In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
In vitro er blevet udviklet transskription assays og bredt anvendt i mange år til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i transskription. Denne proces kræver multi-subunit DNA-afhængig RNA-polymerase (RNAP) og en række transkriptionsfaktorer, som virker til at modulere aktiviteten af RNAP under genekspression. Sekventering gelelektroforese af radioaktivt mærkede udskrifter bruges til at give detaljerede mekanistisk information om, hvordan transskription provenu og hvilke parametre kan påvirke den. I denne artikel beskriver vi protokollen at undersøge, hvordan det væsentlige elongeringsfaktor NusA regulerer transkriptionel pause, såvel som en fremgangsmåde til at identificere et antibakterielt middel målretning transkriptionsinitiering gennem hæmning af RNAP holoenzym formation. Disse metoder kan anvendes en som platform for udvikling af yderligere fremgangsmåder til at udforske virkningsmekanismen for de transkriptionsfaktorer, som stadig uklart, såvel som nye antibakterielle agents målretning transkription, som er en underudnyttet lægemiddelmål i antibiotisk forskning og udvikling.
Transkription er den proces, hvor RNA syntetiseres ud fra en specifik DNA-skabelon. I eukaryote celler der er tre forskellige RNAPs: RNAP I transskriberer rRNA forstadier, RNAP II er ansvarlig for syntesen af mRNA og visse små nukleare RNA'er, og syntesen af 5S rRNA og tRNA udføres ved RNAP III. I bakterier, er der kun én RNAP ansvarlig for transkriptionen af alle klasser af RNA. Der er tre stadier af transskription: initiering, forlængelse og ophør. Transskription er en af de mest stærkt regulerede processer i cellen. Hver fase i transskription cyklus repræsenterer en kontrolpost for regulering af genekspression 1. For initiering, RNAP har at associere med en sigma faktor til dannelse holoenzym, som er nødvendige for at dirigere enzymet til specifikke steder kaldes promotorer 2 til dannelse af et åbent promotorkompleks. Efterfølgende en stor suite af transkriptionsfaktorer er ansvarlige for regulering of RNAP aktiviteter i løbet af forlængelse og opsigelse faser. Transkriptionsfaktoren undersøgt her er den stærkt konserveret og essentielt protein, NusA. Det er involveret i reguleringen af transskription pause og opsigelse, samt anti-afslutning i løbet af rRNA syntese 3-5.
In vitro er blevet udviklet transskription analyser som effektive værktøjer til at studere de komplekse regulerende trin under transskription 6. Generelt er et lineært fragment af DNA, herunder en promotorregion kræves som template for transkription. DNA-templaten er normalt dannet ved PCR eller ved linearisering af et plasmid. Oprensede proteiner og NTP'er (herunder en radioaktivt mærket NTP til afsløring formål) tilsættes derefter og produkt analyseret efter den krævede inkubationstid. Brug passende skabeloner og reaktionsbetingelser, har alle faser af transskription blevet undersøgt ved hjælp af denne metode, som har gjort det muligt detaljeret molekylær karakterisering af transcription løbet af det sidste halve århundrede 7. I kombination med oplysninger om den 3-dimensionelle struktur RNAP har det også været muligt at undersøge den molekylære mekanisme af transskription hæmning af antibiotika og antibiotiske kundeemner, og bruge denne information til udvikling af nye og forbedrede lægemidler 8-10.
I dette arbejde er der mange eksempler på, hvordan transskription assays kan anvendes til at bestemme mekanismen for regulering af transkription forlængelse / termineringsfaktor NusA, og hvordan kan bestemmes virkningsmekanismen af et hidtil ukendt transkriptionsinitiering inhibitor bly.
I alle organismer, transkription er et tæt reguleret proces. In vitro transcription assays er blevet udviklet for at tilvejebringe en platform for afprøvning af effekten af transkriptionsfaktorer, små molekyler og transskription inhibitorer. I denne fremgangsmåde papir, blev et assay til generel bakteriel transkription beskrevet. Transskription assays kombineret med sekventering gelelektroforese af transkripter er meget vigtige for mekanistiske undersøgelser, da de tillader visualisering af alle transkript…
The authors have nothing to disclose.
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Obtain the proteins required for transcription assay | |||
E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
Preparation of DEPC-treated water | |||
diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
RNase-free water | |||
Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
DNA template preparation | |||
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
PCR primers | |||
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
NTP Preparation | |||
ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
RNA ladder preparation | |||
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
T7 RNAP | Promega | P2075 | |
Gel preparation | |||
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Transcription Assay | |||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
Transcription buffer | |||
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Filter paper | |||
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Radioactive decontaminant | |||
Decon 90 | decon | decon90 | |
Gel Treatment | |||
Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |