Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
Les essais in vitro de transcription ont été mis au point et largement utilisé depuis de nombreuses années pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la transcription. Ce processus nécessite plusieurs sous-unités d'ARN-polymérase ADN-dépendante (RNAP) et une série de facteurs de transcription qui agissent pour moduler l'activité de RNAP pendant l'expression génique. gel de séquençage électrophorèse des transcrits radiomarqués est utilisé pour fournir des informations mécaniste détaillées sur la façon de transcription produit et quels paramètres peuvent l'affecter. Dans cet article, nous décrivons le protocole pour étudier la manière dont le facteur d'élongation essentiel NusA régule la transcription de pause, ainsi qu'une méthode pour identifier un agent antibactérien ciblage initiation de la transcription par l'inhibition de la formation holoenzyme RNAP. Ces méthodes peuvent être utilisées comme une plate-forme pour le développement d'approches supplémentaires pour explorer le mécanisme d'action des facteurs de transcription qui restent encore peu clair, ainsi que de nouvelles agen antibactériennets ciblant la transcription qui est une cible de médicament sous-utilisé dans la recherche et le développement d'antibiotiques.
Introduction
La transcription est le processus dans lequel l'ARN est synthétisé à partir d'une matrice d'ADN spécifique. Dans les cellules eucaryotes, il existe trois RNAPs distincts: I ARNP transcrit précurseurs ARNr ARNP II est responsable de la synthèse de l'ARNm et de certains petits ARN nucléaires, ainsi que la synthèse de l'ARNr 5S et ARNt est réalisée par ARNP III. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul ARNP responsable de la transcription de toutes les classes d'ARN. Il y a trois étapes de transcription: initiation, l'élongation et la terminaison. La transcription est l'un des procédés les plus réglementés dans la cellule. Chaque étape du cycle de transcription représente un point de contrôle pour la régulation de l' expression des gènes 1. Pour l' initiation, ARNP doit associer à un facteur sigma pour former une holoenzyme, qui est nécessaire pour diriger l'enzyme à des sites spécifiques appelés promoteurs 2 pour former un complexe promoteur ouvert. Par la suite, une grande suite de facteurs de transcription sont responsables de la réglementation oactivités f RNAP pendant l'allongement et de terminaison phases. Le facteur de transcription examiné ici est la protéine hautement conservée et essentielle, NusA. Il est impliqué dans la régulation de la transcription en pause et la résiliation, ainsi que des anti-terminaison au cours de la synthèse de l' ARNr 3-5.
Les essais in vitro de transcription ont été développés comme des outils puissants pour étudier les étapes réglementaires complexes lors de la transcription 6. D'une manière générale, un fragment linéaire d'ADN comprenant une région promotrice est requise en tant que matrice pour la transcription. La matrice d'ADN est habituellement généré par PCR ou par linéariser un plasmide. les protéines et les PNT (y compris une NTP radiomarqué à des fins de détection) purifiés sont ensuite ajoutés et le produit analysé après la période d'incubation requise. Utilisation de modèles appropriés et des conditions de réaction, toutes les étapes de la transcription ont été examinés en utilisant cette approche qui a permis la caractérisation moléculaire détaillée de transcription au cours du dernier demi – siècle 7. En combinaison avec des informations sur la structure en 3 dimensions de RNAP il a également été possible de sonder le mécanisme moléculaire de l' inhibition de la transcription par les antibiotiques et conduit aux antibiotiques, et utiliser cette information dans le développement de nouveaux médicaments améliorés 8-10.
Dans ce travail, nous fournissons des exemples de tests de transcription peuvent être utilisés pour déterminer le mécanisme de régulation par allongement de la transcription / facteur de terminaison NusA, et comment le mécanisme d'action d'une nouvelle initiation de la transcription inhibiteur de plomb peut être déterminée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans tous les organismes, la transcription est un processus étroitement régulé. Les essais in vitro de transcription ont été développés pour fournir une plate – forme pour tester les effets des facteurs de transcription, des petites molécules et les inhibiteurs de la transcription. Dans cette méthode, le papier, un test pour la transcription bactérienne générale a été décrite. essais de transcription combinés avec un gel de séquençage électrophorèse des transcrits sont très importants pour …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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