In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
In vitro transkripsjon-analyser er blitt utviklet og mye brukt i mange år for å studere de molekylære mekanismer som er involvert i transkripsjon. Denne prosessen krever multi-subenhet DNA-avhengig RNA polymerase (rnap) og en serie av transkripsjonsfaktorer som fungerer for å modulere aktiviteten av rnap i løpet av genekspresjon. Sekvense gel elektroforese av radiomerkede transkripsjoner brukes til å gi detaljert mekanistisk informasjon om hvordan transkripsjons inntektene og hvilke parametere kan påvirke det. I denne beskrivelsen beskriver vi protokollen for å studere hvordan den essensielle elongeringsfaktor Nusa regulerer transkripsjonen midlertidig stopping, så vel som en fremgangsmåte for å identifisere et antibakterielt middel rettet mot transkripsjonsinitiering gjennom hemming av rnap holoenzyme formasjonen. Disse metodene kan brukes som en plattform for utvikling av flere tilnærminger for å utforske virkningsmekanismen av transkripsjonsfaktorer som fortsatt er uklare, så vel som nye antibakterielle agents målretting transkripsjon som er en dårlig utnyttede medikamentmål i antibiotikum forskning og utvikling.
Introduction
Transkripsjon er den prosess hvor RNA syntetiseres fra en spesifikk DNA-templat. I eukaryote celler er det tre distinkte RNAPs: rnap I transkriberer rRNA-forløpere, er rnap II ansvarlig for syntesen av mRNA og visse små nukleære RNA, og syntesen av 5S rRNA og tRNA er utført av rnap III. I bakterier, er det bare én rnap ansvarlig for transkripsjon av alle klasser av RNA. Det er tre stadier av transkripsjon: initiering, forlengelse og avslutning. Transkripsjon er en av de mest regulerte prosesser i cellen. Hvert trinn i syklusen transkripsjon representerer en kontrollpost for regulering av genekspresjonen 1. For initiering, har rnap å assosiere med en sigma faktor for å danne holoenzyme, som er nødvendig for å dirigere enzymet til bestemte steder som kalles aktivatorer 2 for å danne en åpen promoter kompleks. Deretter en stor pakke med transkripsjonsfaktorer er ansvarlig for regulering of rnap aktiviteter i løpet forlengelses og terminerings faser. Transkripsjonsfaktor undersøkt her er svært konservert og viktig protein, Nusa. Det er involvert i regulering av transkripsjon pauser og avslutning, samt anti-avslutning i løpet av rRNA syntese 3-5.
In vitro transkripsjon analyser har blitt utviklet som kraftige verktøy for å studere de komplekse regulatoriske trinnene under transkripsjon 6. Generelt er et lineært fragment av DNA som inneholder en promoter region som kreves som templat for transkripsjon. DNA-templatet blir vanligvis generert ved hjelp av PCR eller ved linearisering av et plasmid. Rensede proteiner og NTPs (inkludert en radioaktivt merket NTP for deteksjonsformål) blir deretter tilsatt, og produktet analysert ved å følge den ønskede inkubasjonsperiode. Ved hjelp av egnede maler og reaksjonsbetingelser, har alle stadier av transkripsjon blitt undersøkt ved hjelp av denne tilnærmingen som har gjort det mulig detaljert molekylær karakterisering av transcription over det siste halve århundret 7. I kombinasjon med informasjon om tre-dimensjonale strukturen av rnap har det også vært mulig å undersøke den molekylære mekanismen for transkripsjon hemming av antibiotika og antibiotika fører, og bruke denne informasjonen i utviklingen av nye og bedre legemidler 8-10.
I dette arbeidet gir vi eksempler på hvordan transkripsjons analyser kan anvendes for å bestemme mekanismen for regulering av transkripsjon forlengelse / opphør faktor Nusa, og hvor mekanismen for virkningen av en ny transkripsjonsinitiering inhibitor bly kan bestemmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I alle organismer, er transkripsjonen en strengt regulert prosess. In vitro-transkripsjon analyser er blitt utviklet for å tilveiebringe en plattform for å teste effektene av transkripsjonsfaktorer, små molekyler og transkripsjons inhibitorer. Ved denne fremgangsmåte papiret, ble en analyse for generell bakteriell transkripsjon er beskrevet. Transkripsjon analyser kombinert med sekvense gel elektroforese av vitnemål er svært viktig for mekanistiske studier som de tillater visualisering av alle transkripsj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
