Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
In vitro transkriptionsanalyser har utvecklats och används i stor utsträckning under många år för att studera de molekylära mekanismer som är involverade i transkription. Denna process kräver flera subenhet DNA-beroende RNA-polymeras (RNAP) och en serie av transkriptionsfaktorer som verkar för att modulera aktiviteten hos RNAP under genuttryck. Sekvense gelelektrofores av radioaktivt märkta transkript används för att ge detaljerad mekanistisk information om hur transkription fortgår och vilka parametrar kan påverka det. I detta dokument beskriver vi protokoll för att studera hur viktig förlängningsfaktor Nusa reglerar transkriptions paus, liksom en metod för att identifiera ett antibakteriellt medel inriktning transkriptionsinitiering genom hämning av RNAP holoenzym bildning. Dessa metoder kan användas en som plattform för utveckling av ytterligare metoder för att undersöka verkningsmekanismen av transkriptionsfaktorer som fortfarande oklar, liksom nya antibakteriella agents inriktning transkription som är en underutnyttjad läkemedelsmål i antibiotikaforskning och utveckling.
Introduction
Transkription är den process i vilken RNA syntetiseras från ett specifikt DNA-mall. I eukaryota celler finns tre olika RNAPs: RNAP I transkriberar rRNA prekursorer är RNAP II ansvarig för syntesen av mRNA och vissa små nukleära RNA och syntes av 5S rRNA och tRNA utförs av RNAP III. I bakterier, finns det bara en RNAP ansvariga för transkriptionen av alla klasser av RNA. Det finns tre stadier av transkription: initiering, förlängning och uppsägning. Transkription är en av de mest reglerade processer i cellen. Varje steg i transkriptionscykeln utgör en kontrollpunkt för reglering av genuttryck 1. För initiering har RNAP att associera med en sigma faktor för att bilda holoenzym, som krävs för att styra enzymet till specifika platser kallas promotorer 2 för att bilda en öppen promotor komplex. Därefter en stor svit av transkriptionsfaktorer är ansvariga för reglering of RNAP aktiviteter under förlängnings och avslutningsfasen. Transkriptionsfaktorn granskas här är mycket konserverat och viktigt protein, Nusa. Det är involverad i regleringen av transkription paus och terminering, liksom anti-terminering under rRNA syntes 3-5.
In vitro transkription analyser har utvecklats som kraftfulla verktyg för att studera de komplexa reglerande åtgärder under transkription 6. I allmänhet är ett linjärt fragment av DNA som innefattar en promotorregion som krävs som mall för transkription. DNA-mallen är vanligtvis genereras genom PCR eller genom linjärisering av en plasmid. Renade proteiner och NTP (inklusive ett radioaktivt märkt NTP för detekteringsändamål) tillsätts sedan och produkten analyserades efter den tid som krävs av inkubation. Med hjälp av lämpliga mallar och reaktionsbetingelser, har alla skeden av transkriptions undersökts med hjälp av denna metod som har möjliggjort detaljerad molekylär karakterisering av transcription under det senaste halvseklet 7. I kombination med information om 3-dimensionella strukturen av RNAP har det också varit möjligt att undersöka den molekylära mekanismen av transkription hämning av antibiotika och antibiotika leder, och använda denna information för att utveckla nya, förbättrade läkemedel 8-10.
I detta arbete har vi ger exempel på hur transkriptionsanalyser kan användas för att bestämma mekanismen för reglering av transkriptions förlängning / avslutningsfaktor Nusa, och hur verkningsmekanismen av en ledning ny transkriptionsinitiering hämmare kan bestämmas.
Protocol
Representative Results
Discussion
I alla organismer, är transkription en hårt reglerad process. In vitro transkription analyser har utvecklats för att ge en plattform för att testa effekterna av transkriptionsfaktorer, små molekyler och transkriptionshämmare. I denna metod papper, var en analys för allmän bakteriell transkription beskrivs. Transkriptionsanalyser i kombination med sekvense gelelektrofores av transkript är mycket viktiga för mekanistiska studier eftersom de möjliggör visualisering av alla transkriptionsprodukter läng…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
