사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현
Summary
분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.
Abstract
펨토초 티타늄 합성 레이저 스캐닝 현미경 : 레이저 라인을 복제하는 사파이어 레이저 및 광 파라 메트릭 발진 (OPO)은 생물학 가능하게되었다. 이 시스템은 기본적으로 멀티 채널 이광자 형광 현미경을 위해 설계된다. 그러나, 임의의 수정없이, 상기 제 2 고조파 발생 (SHG) 또는 3 고조파 발생 (THG) 보완 비선형 광학 현미경은 구성 분자 또는 수성 중간의 라벨없는 결상을 가능하게 세트해서 수행 될 수있다 지질 인터페이스. 이러한 기술은 생체의 관찰에 적합하지만, 화학적 특성으로 제한된다. 선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 공 초점 라만 현미경은 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간이 필요하다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 레이저 기술의 최근 발전은 (STABLE)을 허용했다비선형 광학 진동 현미경의 opment, 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만에 (CARS)을 산란. CARS 현미경 따라서 화학적으로 매핑 (OH 신축 진동을 통해) (CH 신축 진동을 통해) 지질, 물, 단백질이나 DNA에 의해 생물학적 라이브 세포 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 본 연구에서 우리는 표준 OPO 결합 광자 레이저 스캐닝 현미경에 CARS 기술의 구현을 설명한다. 이것은 레이저 빔의 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 2 개의 레이저 라인의 시간 동기에 근거한다. 우리는 기존 광자 시스템에서이 기법의 단계별 구현을 제시한다. 실험 광학의 기본 배경은 도움이되고 제시된 시스템은 고가의 추가 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 또한 쥐의 좌골 신경의 수초에 얻은 이미징 CARS을 설명하고, 우리는이 영상이 같은 표준 t 다른 비선형 광학 이미징, 동시에 수행 할 수 있음을 보여WO 광자 형광 기법 및 제 고조파 발생.
Introduction
광학 현미경은 세포 내 해상도로 생물학적 시스템을 살고 동적 프로세스의 비파괴 시각화를위한 주요 기술이되었다. 형광 현미경으로 인해 높은 특이 도와 민감도 1 생균 현재 가장 많이 사용되는 영상의 대비이다. 형광 프로브의 큰 팔레트 (외인성 색소, 유전자 인코딩 단백질, 반도체 나노 입자를) 등장했습니다. 다양한 샘플 조명 형광 기반 기술은 3 차원 영상을 수행하고 2 photobleaching에되는이 기술의 주요 단점을 줄이기 위해 (예 촛점 또는 이광자 현미경 등) 번성하고있다. 분자 종의 대부분은 본질적으로 형광하지 않으며, 따라서 이러한 형광 인위적으로 몇 군데 샘플에 도입 할 필요가 있기 때문에 다른 제한은 형광 라벨의 요구 사항을 포함한다. 이 인공 조작은 작은 분자 특히 파괴적이거나 냄비를 유도 할 수있다ential 사진 독성. 이러한 이유는 생체 관측 형광 현미경하지가 적합합니다. 따라서, 형광성 분자의 사용없이 고감도 특정 분자 대조 광학 이미징 기술의 사용은 바이오 메디컬 사이언스에서 매우 바람직하다.
라벨이나 얼룩없이 여러 비선형 광학 이미징 기술은 두 번째 고조파 세대 (SHG) 3,4와 세 번째 고조파 세대 (THG) 5를 포함 등장했다. SHG 현미경은 미세 소관 또는 콜라겐 6으로 초분자 레벨에서 화상 구조 배치로 사용되어왔다. THG는 수성 매질 및 지질 (7) 사이의 인터페이스로서 광 이질성로부터 생성된다. THG는 이미지 수초 8,9로 증명되었다. 두 기술들은 이광자 형광 현미경상에서 구현 오직 하나의 레이저 빔을 필요로 할 수있다. 이들은 높은 전력 레이저 강도를 필요로하지만 (전형적으로 50생활 샘플에 해로운이며, 명확하게 이미지 특정 생물학적 구조에 필요한 화학적 특이성을 제공하지 않는 THG 9 1,180 ㎚), 50 mW의 – SHG (10), (25) 860 nm에서 mW의.
선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 분자 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 광 빔 상관 닿으 광자 흡수 자나 분자에 의해 산란 될 수있다. 산란 된 광자의 대부분은 입사 광자 에너지와 같은, 즉, 주파수를 가질 것이다. 이 프로세스는 레일리 산란이라고한다. 그러나, 광자 소수 라만 산란이라 비탄성 산란 과정, 즉, 입사 광자의 주파수와 다른 주파수의 광 산란한다. 에너지의 차이는 분자 구조 및 환경에 따라 진동 모드의 여기로부터 기인한다. 따라서, 자발 라만 산란 잠십오 화학적으로 선택적 영상은 다른 분자는 특정 진동 주파수를 가지고있다. 그러나 그것 때문에 매우 약한 신호의 제한됩니다. 공 초점 라만 현미경이 개발 및 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간 (11)을 필요로하고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 레이저 기술의 최근 발전은 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란의 비선형 광학 진동 현미경의 상승 (CARS) 11,12,13 수있다.
CARS는 3 차 비선형 광학 과정이다. 주파수 ω의 P에 펌프광 구성된 세 개의 레이저 빔은 주파수 ω의 S에서 스톡스 광 및 프로브 빔 (주로 펌프 임) 시료에 집중되고 (주파수 ω AS =에서 반 스톡스 빔을 생성 2ω P – ω의 S) 14. 안티 – 스토크 스 신호를 크게 향상시킬 수있을 때, 주파수 차이(- ω S ω P) 펌프와 스톡스 라만 분자 진동 Ω의 R =로 조정되어 빔 사이. CARS 신호는 다수의 광자 상호 작용을 기반으로합니다. 따라서, 자발 라만 산란 강도보다 강한 간섭 신호의 순서를 생성한다.
CARS 현미경은 제 실험적 던컨 등. (15)에 의해 입증되었다. Zumbusch 외는. 높은 개구 수의 대물 렌즈를 두 초점 근적외선 펨토초 레이저 빔을 이용하여 CARS의 위상 정합 조건을 허용하고 이광자 비 공진 배경 (16)을 회피하여, 그 기술을 향상시켰다. CARS 현미경 따라서 화학적으로 살아있는 세포 (19, 20)을로 (CH 신축 진동을 통해) 지질 같은 분자 (17, 18), 물 (OH 신축 진동을 통해), 단백질, DNA를 검출함으로써, 살아있는 세포와 조직 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다 또한 화학 물질 화합물을 중수 소화제약 (21) 및 화장품 응용 프로그램 (22)에 대한의.
비선형 현미경의 가장 큰 한계는 복잡성과 광원의 비용에서 기인한다. CARS 시스템은 짧은 펄스 기간과 시간적 및 공간적 동기화 펄스 트레인 두 파장 가변 레이저가 필요합니다. 초기 CARS 현미경은 두 개의 동기화 된 피코 초 티를 기반으로했다 : 사파이어 레이저 (20). 초 연속 광원 (23)을 생성하는 사파이어 레이저 : CARS 이미징은 단일 펨토초 TI의 얻었다. 최근에, 단일 펨토초 Ti로 이루어지는 레이저 소스 : 가변 광 파라 메트릭 발진기 (OPO)를 펌핑 사파이어 레이저는 CARS 현미경에 사용되어왔다. 이 셋업은 본질적으로 일시적으로 펌프와 전체 분자 진동 스펙트럼 (24)을 포함 스톡스 빔 사이의 주파수의 차이 빔을 동기화 허용한다. 또한, 레이저 주사 현미경 턴에 기초주로 두 광자 형광 (TPF)에 사용되는 키 FS 레이저와 OPO가 아닌 물리학에 대해 사용할 수 있습니다. 각 비선형 (NLO) 영상 기법은 특정 구조 나 분자에 민감하기 때문에 이러한 셋업의 전위가 크게 다른 비선형 광학 영상의 혼입에 의해 보충 투자를 필요로하지 않고 향상 될 수있다. 복합 NLO 촬상 따라서 복잡한 생물학적 시료 25 NLO 현미경의 전위 대문자. 이러한 기술의 결합은 지질 대사, 피부 암 개발 (26), 골격 근육 발달 (27), 동맥 경화성 병변 (28)에 특히 많은 생물 학적 질문의 조사를 허용했다. 또한 CARS과 레이저 빔 주사의 구현은 고속 촬상, 즉 생체 역학 과정을 연구하기위한 매력적인 도구의 기능을 제공한다.
이 연구의 목적은 t을 구현하는 각 단계를 보여주는 것입니다표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 그는 CARS 기술. 현미경은 FSEC 티를 기반으로 : 사파이어 레이저와 OPO : 생물 학자를위한 소프트웨어에 의해 동작합니다 (티 의해 펌핑 레이저 사파이어). 통합 시간에 두 개의 빔을 동기화하기 위해 상기 레이저 빔 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 수행 하였다. 우리는 실험 광학의 기본적인 배경을 필요로이 기술의 단계별 구현을 설명합니다. 우리는 또한 CARS는 쥐의 좌골 신경의 수초에서 얻은 영상 설명, 우리는이 영상은 표준 두 광자 형광 기술과 두 번째 고조파 세대로, 다른 비선형 광학 영상을 동시에 수행 할 수 있습니다 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
작품의 가장 어려운 부분은 레이저 빔의 시간 동기화된다. 그것은 빠른 오실로스코프와 결합 된 빠른 광 다이오드를 필요로하지만, 시간 만 거친 중복 처음에 수행 할 수 있습니다. 그 후 몇 cm의 추가적인 조정이 필요하다. 마지막으로, 선형 변환 스테이지 마이크로 미터에 의해 이동은 CARS 신호를 트리거하기 위해 지연 라인 길이의 최종 미세 조정을 행하는 허용한다. 변환 스테이지 마이크로 드?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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