Genomförandet av en enhetlig Anti-Stokes Ramanspridning (CARS) System på en Ti: Sapphire och OPO laserbaserade Standard Laserskanning Mikroskop
Summary
Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi baserad på inneboende vibrationer molekyl obligationer tillåter etikett fri kemiskt selektiv levande cell imaging. Detta arbete presenteras genomförandet av en kompletterande mikroskopi teknik på en vanlig multifotonlaserskanning mikroskop baserad på en femtosekund Ti: safir laser och en OPO laser.
Abstract
Laser scanning mikroskop som kombinerar en femtosekund Ti: safir laser och en optisk parametrisk oscillator (OPO) att duplicera laserlinjen har blivit tillgängliga för biologer. Dessa system är i första hand avsedd för flerkanals två-foton fluorescensmikroskopi. Men utan några ändringar, kompletterande icke-linjär optisk mikroskopi såsom andra övertonen generationen (SHG) eller tredje harmoniska generationen (THG) kan också utföras med detta set-up, vilket gör att etikettfritt avbildning av strukturerade molekyler eller vatten medellång lipid gränssnitt. Dessa tekniker är väl lämpade för in vivo-observation, men är begränsade i kemisk specificitet. Kemiskt selektiv avbildning kan erhållas från inneboende vibrationssignaler baserade på Raman-spridning. Konfokala Raman mikroskopi ger 3D spatial upplösning, men det kräver hög medeleffekt och lång förvärvstid. För att övervinna dessa svårigheter har de senaste framstegen inom laserteknologin möjliggjort devellingen av icke-linjär optisk vibrations mikroskopi, särskilt konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS). CARS mikroskopi har därför framträtt som ett kraftfullt verktyg för biologisk och levande cell imaging, genom kemisk kartläggning lipider (via CH stretch vibrationer), vatten (via OH stretch vibrationer), proteiner eller DNA. I detta arbete, beskriver vi genomförandet av CARS tekniken på en vanlig OPO kopplade multifotonlaserskanning mikroskop. Den är baserad på in-time synkronisering av de två laserlinjer genom att justera längden av en av laserstrålens bana. Vi presenterar en steg-för-steg genomförandet av denna teknik på en befintlig multifotonsystem. En grundläggande bakgrund i experimentell optik är hjälpsamma och presenterade systemet inte kräver dyr kompletterande utrustning. Vi visar också BILAR avbildning som erhållits på myelinskidorna av ischiasnerven hos gnagare, och vi visar att denna avbildning kan utföras samtidigt med andra icke-linjär optisk avbildning, såsom standard two-foton fluorescensteknik och andra harmoniska generationen.
Introduction
Optisk mikroskopi har blivit en viktig teknik för oförstörande visualisering av dynamiska processer i levande biologiska system med en subcellulär upplösning. Fluorescensmikroskopi är för närvarande den mest populära imaging kontrasten i levande celler på grund av sin höga specificitet och sensitivitet 1. En stor palett av fluorescerande prober har uppstått (exogena färgämnen, genetiskt kodade proteiner, halvledarnanopartiklar). Olika provbelysning fluorescensbaserade tekniker har blomstrat (såsom konfokal eller två foton mikroskopi) för att utföra 3D-avbildning och för att minska en största nackdelen med denna teknik som är fotoblekning 2. Andra begränsningar inkluderar kravet på fluoroforen märkning eftersom de flesta av molekylslag är inte i sig fluorescerande och därför dessa fluoroforer måste artificiellt införts i den avbildade provet. Denna konstgjorda manipulation kan vara störande, särskilt för små molekyler eller inducerar krukarential- foto-toxicitet. Dessa skäl gör fluorescensmikroskopi inte väl lämpade för in vivo observationer. Därför är mycket önskvärt i biomedicinsk vetenskap användningen av optiska avbildningstekniker med hög känslighet och specifika molekylära kontraster utan användning av fluorescerande molekyler.
Flera icke-linjära optiska avbildningstekniker utan märkning eller färgning har dykt upp, bland annat andra harmoniska generationen (SHG) 3,4 och tredje harmoniska generationen (THG) 5. SHG mikroskopi har använts för att bild strukturella arrangemang på den supramolekylära nivå som mikrotubuli eller kollagen 6. THG genereras från optiska heterogeniteter såsom gränssnitt mellan ett vattenbaserat medium och lipider 7. THG visades också till bild myelin 8,9. Båda teknikerna kan genomföras på ett två-foton fluorescensmikroskop och kräver endast en laserstråle. Men de kräver hög effekt laserintensitet (typiskt 50mW vid 860 nm för SHG 10, 25-50 mW vid 1180 nm för THG 9), som är skadlig i levande prover, och ger inte den kemiska specificitet som krävs för att entydigt bild specifika biologiska strukturer.
Kemiskt selektiv avbildning kan erhållas från inneboende molekylära vibrationssignaler baserade på Raman-spridning. När en ljusstråle träffar materia, kan fotoner absorberas och sprids av atomer eller molekyler. De flesta av de spridda fotoner kommer att ha samma energi, dvs, frekvens, som den infallande fotoner. Denna process kallas Rayleigh-spridning. Emellertid kommer ett litet antal fotoner vara utspridda vid en optisk frekvens som skiljer sig från frekvensen hos de infallande fotonerna, det vill säga, med en inelastisk spridning process som kallas Raman-spridning. Skillnaden i energi härrör från excitering av vibrationslägen beroende på molekylstrukturen och miljö. Därför spontan Raman spridnings provIdes kemiskt selektiv avbildning som olika molekyler har specifika vibrationsfrekvenser. Det är dock begränsad på grund av dess extremt svag signal. Confocal Raman mikroskopi har utvecklats och ger 3D rumslig upplösning, men det kräver hög medeleffekt och lång förvärvs tid 11. För att övervinna dessa svårigheter, har de senaste framstegen inom laserteknik får ökningen av icke-linjära optiska vibrations mikroskopi, särskilt konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS) 11,12,13.
CARS är en tredje ordningens ickelinjära optiska process. Tre laserstrålar, som består av en pumpstråle vid frekvensen ω P, är en Stokes balk vid frekvensen ω S och en sondstråle (oftast är den pump) inriktat i ett prov och generera en anti-Stokes-stråle vid frekvensen ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. Den anti-Stokes signal kan förbättras avsevärt när frekvensskillnadenmellan pumpen och Stokes balkar är inställd på en Raman molekylär vibration Ω R = (ω P – ω S). CARS signalen är baserad på flera interaktion foton. Det genererar därför en sammanhängande signalstorleksordningar starkare än spontan Raman-spridning.
CARS mikroskopi först experimentellt demonstreras av Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Förbättrats sedan tekniken, genom att använda två fokuserade nära infraröda femtosecond laserstrålar med en objektiv med hög numerisk öppning, vilket gör att fasanpassning bilkondition och undvika de två-photon icke-resonant bakgrund 16. CARS mikroskopi har därför framträtt som ett kraftfullt verktyg för levande cell och vävnader avbildning, genom att kemiskt upptäcka molekyler såsom lipider (via CH stretch vibration) 17,18, vatten (via OH stretch vibrationer), proteiner, DNA i levande celler 19,20 men också deutererad kemisk förenings för farmaceutisk 21 och kosmetiska tillämpningar 22.
Den största begränsningen av olinjära mikroskopi härrör från komplexiteten och kostnaden för de optiska källorna. Ett CARS system kräver två våglängder avstämbara lasrar med korta pulsvaraktig och med tid och rum synkroniserade pulstågen. Tidiga bilar mikroskop baserades på två synkroniserade pikosekund Ti: safirlasrar 20. BILAR avbildning erhölls också från en enda femtosecond Ti: safir laser genererar en supercontinuum ljuskälla 23. Nyligen laserkällor som består av en enda femtosecond Ti: har safir laser att pumpa en avstämbar optisk parametrisk oscillatorer (OPO) använts för CARS mikroskopi. Detta upplägg gör i sig tidsmässigt synkroniserade strålar med en skillnad på frekvens mellan pumpen och Stokes trålen täcker hela molekylära vibrationsspektrum 24. Dessutom laserscannande mikroskop baserat på en omsättningnyckel fs laser och en OPO, i första hand för två-photon fluorescens (TPF) finns nu tillgängliga för icke-fysiker. Potentialen för sådana uppställningar kan förbättras avsevärt utan att det krävs kompletterande investeringar genom införlivandet av andra icke-linjär optisk avbildning, eftersom varje icke-linjära (NLO) imaging modalitet är känsliga för specifika strukturer eller molekyler. Multimodal NLO imaging aktiverar därför potentialen hos NLO mikroskopi för komplexa biologiska prover 25. Kopplingen av dessa tekniker har gjort undersökningen av många biologiska frågor, i synnerhet på lipidmetabolismen, hud eller cancerutveckling 26, skelettmuskelutveckling 27 aterosklerotiska lesioner 28. Dessutom ger genomförandet av laserstrålen scanning med bilar förmåga att med hög hastighet avbildning, dvs en tilltalande verktyg för att studera dynamiska processer in vivo.
Syftet med detta arbete är att visa varje steg att genomföra than CARS teknik på en vanlig multifotonlaserskanning mikroskop. Mikroskopet är baserad på en fsec Ti: safir laser och en OPO (pumpas av Ti: safir-laser) som drivs av en mjukvara för biologer. Integreringen utfördes genom att justera längden på en av laserstrålens bana för att synkronisera i tid de båda strålarna. Vi beskriver steg-för-steg genomförandet av denna teknik, som endast kräver grundläggande bakgrund i experimentella optik. Vi visar också BILAR avbildning erhålls på myelinskidorna av ischiasnerven hos gnagare, och vi visar denna avbildning kan utföras samtidigt med andra icke-linjär optisk avbildning, såsom standard två-foton fluorescensteknik och andra harmoniska generationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest utmanande delen av arbetet är tidssynkronisering av laserstrålarna. Det kräver en snabb fotodiod i kombination med en snabb oscilloskop, men endast en grov överlappning i tid kan utföras i början. Sedan en ytterligare justering av några cm krävs. Slutligen mikrometer flyttas från en linjär förflyttning skede tillåter att utföra den slutliga finjusteringen av fördröjnings radlängden för att utlösa CARS signalen. Denna signal hålls i ett snävt intervall av cirka 20 mikrometer, såsom observera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
