إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
تعظيم الاستفادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) للأبحاث، والنمذجة المرض والأدوية والتطبيقات السريرية يتطلب أساليب قوية للإنتاج على نطاق واسع من أنواع الخلايا الوظيفية، بما في ذلك العضلية. هنا علينا أن نظهر أن التلاعب الزمني للWNT، TGF-β، وSHH مسارات إشارات تؤدي إلى خطوط hPSC كفاءة عالية cardiomyocyte تمايز وحيدة الخلية passaged في كل تعليق ثابت وأنظمة التعليق مفاعل حيوي أثار. توظيف هذه الاستراتيجية أدت إلى ~ 100٪ الضرب الكروية، التي تحتوي على الدوام> 80٪ التروبونين القلبي خلايا T إيجابية بعد 15 يوما من الثقافة، والتحقق من صحة في خطوط hPSC متعددة. نفيدكم أيضا على الاختلاف من هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا لم تتكيف حاليا إلى الركض وحيدة الخلية، وقد تم التحقق من نجاح الذي في 42 خطوط hPSC. العضلية تم إنشاؤها باستخدام هذه البروتوكولات التعبير عن علامات-نسب محددة، ومن المتوقع عرض electrophysوظائف iological. يقدم بروتوكول لدينا منصة بسيطة وفعالة وقوية لإنتاج على نطاق واسع العضلية الإنسان.
Introduction
خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، لديها القدرة على تجديد الذات والقدرة على التمايز إلى خلايا ثلاث طبقات جرثومية جنينية 1،2. ونظرا لهذه الخصائص، وتوفر hPSCs مصدرا قيما وغير محدودة لتوليد وقابلة للإنتاج أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر 3-5، لالإنتاجية العالية فحص المخدرات وسمية المقايسات 6،7 ويحتمل أن تكون للتطبيقات السريرية 8 . جيل الخلايا العضلية من hPSCs يوفر فرصة للتحقيق على وجه التحديد آليات أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية المعقدة والعلاجات الممكنة، في وقت سابق خارج نطاق قدراتنا نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية ذات الصلة و / أو توافر الأنسجة الأساسية المتضررة.
جميع التطبيقات المذكورة أعلاه hPSCs نecessitate إنتاج أعداد هائلة من العضلية عالية التخصيب والوظيفية. وهكذا، فإن توافر الكفاءة واستنساخه وقابلة للتطوير في المختبر بروتوكول تمايز القلب مناسبة لخطوط hPSC متعددة أمر بالغ الأهمية. وقد استخدمت التقليدية بروتوكولات cardiomyocyte التمايز استراتيجيات مختلفة مثل تشكيل هيئة مضغي 9، تقنيات شارك في الثقافة 10، الاستقراء مع الكوكتيلات السيتوكينات 11 و طرق بروتين تنبيغ 12. وعلى الرغم من التقدم في هذه التقنيات، معظمها لا يزال يعاني من ضعف كفاءة، تتطلب عوامل النمو مكلفة، أو تقديم العالمية محدود عند محاولة استخدام خطوط hPSC متعددة. حتى الآن، وقد وضعت هذه التحديات حدود لإنتاج الخلايا العضلية المستمدة hPSC للدراسات العلاج بالخلايا في النماذج الحيوانية، وكذلك في مجال الصناعات الدوائية لاكتشاف الأدوية 13. ولذلك، فإن تطوير تقنيات قوية وبأسعار معقولة لكبيران الانتاج -scale من الوظائف العضلية المستمدة hPSC في أنظمة ثقافة قابلة للتسهيل إلى حد كبير من التطبيقات التجارية والسريرية الخاصة بهم.
في هذه المخطوطة، ونحن التقرير تطور نظام التمايز القلب فعالة من حيث التكلفة ومتكامل مع كفاءة عالية، واستنساخ وتطبيق لhESCs وhiPSCs ولدت من مجموعة متنوعة من المصادر والأساليب الثقافة، بما في ذلك وسيلة لإنتاج على نطاق واسع للغاية السكان المخصب العضلية المستمدة hPSC باستخدام مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، لدينا الأمثل هذا البروتوكول لخطوط hPSC لا تتكيف مع المغذية ثقافة الخلية الحرة و / أو واحدة، مثل hiPSCs المنشأة حديثا أو أفواج كبيرة من خطوط hPSC ذات الصلة لتحليل آلية المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
العضلية المستمدة من hPSCs تعتبر مصدرا جذابا للغاية لاستخدامها في نماذج الأمراض التي تصيب البشر، المخدرات فحص / اختبار السمية، وربما في المستقبل، علاجات التجدد. واحدة من العقبات الرئيسية لاستخدام هذه الخلايا ومع ذلك، هو القدرة على توفير ما يكفي من مواد ذات جودة عالية ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
