直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影
Summary
このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。
Abstract
直接血栓イメージングは、血栓塞栓性梗塞の根本的な原因を可視化します。画像血栓にできることは、直接、間接測定に頼るのではなく、ストロークのはるかに優れた調査を可能にし、強力かつ堅牢な血管研究ツールとなります。我々は、分子イメージング血栓マーカーで血栓をラベル光イメージングアプローチを使用します – 共有結合血塊成熟のプロセス中に活性化凝固第XIIIa因子のフィブリン架橋酵素作用によって血栓のフィブリン鎖にリンクされたCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブ。フィブリン：マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）ベースのアプローチは、血餅の主要な構成要素を標的とするために、官能血栓求めて金ナノ粒子（AuNPs）を使用しています。本論文では、in vivoマイクロCT で合わせ、塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓のex vivo NIRFイメージングのための詳細なプロトコルを記述しています。我々は、in vivoであることを示します</ em>のマイクロCTおよびフィブリン標的グリコールキトサンAuNPsは（FIB-GC-AuNPs）の両方の現場での血栓や脳塞栓血栓で可視化するために使用することができます。我々はまた、直列組織プラスミノーゲン活性化因子媒介血栓溶解の治療効果をモニターするためのin vivoマイクロCTに基づく直接血栓イメージングの使用を記載しています。最後のイメージングセッションの後、我々は、ex vivoで NIRFがエクステントと脳内の残留血栓塞栓の分布を画像化することによって実証します。最後に、我々は定量的なイメージがマイクロCTとNIRFイメージングデータの分析について説明します。 ex vivoで NIRFイメージング対in vivoでの hyperdenseのマイクロCT血栓のボリューム上の血栓関連の蛍光シグナルの面積を：直接血栓イメージングを組み合わせた手法は、血栓の可視化の、2つの独立した方法を比較することができます。
Introduction
6人に1人は生涯のある時点でのストロークを持っています。虚血性脳卒中は、これまでで最も一般的なストローク型であり、すべての脳卒中症例の約80パーセントを占めています。血栓塞栓は、これらの虚血性脳卒中の大部分を引き起こすので、直接血栓イメージングへの関心が高まっています。
これは、200万人の脳細胞がスローガン「時間が脳である」につながる、中大脳動脈閉塞1の毎分の間に死亡していると推定されました。コンピュータ断層撮影（CT）の研究が急速に行われ、広く利用可能であることができます。このため、CTは、初期診断及び超急性虚血性脳卒中の治療のための選択のイメージング残ります。血栓溶解のための組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を投与すること、および/または血管内凝血塊-検索2にトリアージ：CTは重要な初期の決定を通知するための特に価値があります。現在のCTベースの血栓イメージング、しかし、シリアル大脳を追跡することはできませんin vivoでのリットルの血栓塞栓、それは間接的な方法を使用しているためには、血栓を実証するために：ヨード造影により血液プールの不透明化した後、血栓が血管内の欠陥を埋めることが証明されています。このように、血栓の繰り返しイメージングを排除ヨード造影の反復投与に関連した線量限度とリスクがあります。
したがって、より速く、より良い治療法の決定なされるようにする脳卒中患者における脳血栓の直接イメージング法のための重要な必要性があります。我々は、血栓を求めるナノ粒子、分子造影剤を使用して、CT、ストロークのために現在使用される現場の撮像モダリティの値を高めることによってこれを達成することを提案します。
我々は、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）、迅速なデータ収集を可能にするCTの高解像度のエクスビボまたはインビボ （小動物）イメージングバージョンを使用して、この薬剤の使用を実証しています<SUP> 3,4。でも小動物マイクロCT（人間サイズのスキャナから入手できるよりはるかに悪い）ために利用可能な比較的弱い軟部組織コントラストで、造影剤は、分子によって強化された「密な血管記号 'それらCT上hyperdense行うことで、血栓を追求し、マークすることができましたイメージング。
CT技術を補完するものとして、当社グループは、以前に脳の血栓負担5を視覚化するのCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブを用いた光直接血栓イメージング技術を開発しました。これは、死後脳でのex vivoでの技術ですが、非常に敏感であり、研究の設定in vivoのデータで確認するためのものです。
CTとNIRF両方基づく血栓を求めるイメージング技術を持つことは、私たちが虚血性脳卒中の開発の過程における血栓および血栓イメージングの役割に非常に有益なデータを達成するためにこれらの技術を比較対照することができます。
HERE、我々は、in vivoマイクロCTおよびex vivo NIRFイメージングの組み合わせ技術の詳細なプロトコルは直接塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓を視覚化することについて説明します。これらのシンプルで堅牢な方法は提供していますex vivoでのデータが続き、治療中にin vivoでの迅速かつ定量的にダイナミックな血栓進化の血栓負担/分布と特性評価のin vivo評価に正確を可能にすることによって、血栓性疾患の我々の理解を進めるために有用ですin vivoイメージング所見を確認するための制御および参照標準として。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、塞栓性脳卒中の実験モデルにおいて直接血栓イメージングのための2つの相補的な分子イメージング技術の使用を実証：in vivoでのマイクロCTベースの撮像のためのフィブリン標的金ナノ粒子（FIB-GC-AuNP）を、および活性化XIII因子は、 元のための光学イメージングプローブを標的蛍光イメージングを生体内 。
FIB-GC-AuNPsの静脈内投与後、血栓は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、韓国医療技術のR＆Dプロジェクト、厚生省（HI12C1847、HI12C0066）、バイオ・医療技術開発プログラム（2010から0019862）およびグローバル・リサーチ・ラボ（GRL）プログラム（NRF-2015K1A1A2028228）によってサポートされていました韓国政府によって資金を供給国立研究財団、。
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
References
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