Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Abstract

Direkte Abbildung von Thromben visualisiert die Ursache von thromboembolischen Infarkt. Die Möglichkeit, direkt mit Bild Thrombus ermöglicht viel bessere Untersuchung von Schlaganfall als auf indirekte Messungen angewiesen ist, und wird eine starke und robuste vaskuläre Forschung Werkzeug sein. Wir verwenden eine optische Abbildungs ​​Ansatz, der Thromben mit einem molekularen Bildgebung Thrombus Marker-Etiketten – a Cy5.5 nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) -Sonde, die an die Fibrinstränge des Thrombus durch die Fibrin-Vernetzungs enzymatischen Wirkung des aktivierten Gerinnungsfaktors XIIIa während des Prozesses der Gerinnsel Reifung kovalent verknüpft ist. Ein Mikro-Computertomographie (microCT) -basierte Ansatz nutzt Thrombus such Gold-Nanopartikel (AuNPs) die Hauptkomponente des Gerinnsels Ziel funktionalisiert: Fibrin. Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll für den kombinierten in vivo und ex vivo microCT NIRF Bildgebung von Thromboembolien in einem Mausmodell der embolischen Schlaganfall. Wir zeigen , dass in vivo </ em> microCT und Fibrin-bezogene Glykol-Chitosan – AuNPs (fib-GC-AuNPs) kann zur Visualisierung sowohl in situ Thromben und zerebraler embolischer Thromben verwendet werden. Wir beschreiben auch die Verwendung von in vivo microCT basierten direkten Abbildung von Thromben zu seriell die therapeutische Wirkung von Gewebe – Plasminogen – Aktivator-vermittelte Thrombolyse überwachen. Nach dem letzten Imaging – Sitzung zeigen wir durch ex vivo NIRF das Ausmaß der Abbildung und die Verteilung der Rest Thromboembolien im Gehirn. Schließlich beschreiben wir quantitative Bildanalysen von microCT und NIRF Bilddaten. Die kombinierte Technik der direkten Abbildung von Thromben können zwei unabhängige Methoden der Thrombus Visualisierung verglichen zu werden: der Bereich des Thrombus bezogenen Fluoreszenzsignal auf ex vivo NIRF Bildgebung gegenüber dem Volumen von hochdichtem Fliess microCT Thromben in vivo.

Introduction

Eine in 6 Menschen irgendwann in ihrem Leben einen Schlaganfall. Der ischämische Schlaganfall ist bei weitem das häufigste Schlaganfall-Typ, und macht etwa 80 Prozent aller Schlaganfällen. Weil Thromboemboli die meisten dieser ischämische Schlaganfälle verursachen, gibt es ein wachsendes Interesse in direkten Abbildung von Thromben.

Es wurde geschätzt , dass etwa 2 Millionen Gehirnzellen während jeder Minute der Arteria cerebri media Okklusion ^1, was zu dem Motto "Zeit ist Gehirn" sterben. Die Computertomographie (CT) Untersuchungen können schnell durchgeführt werden und sind weit verbreitet; Aus diesem Grund bleibt die Abbildungs ​​CT der Wahl für die Erstdiagnose und Behandlung von hyper ischämischen Schlaganfall. CT ist besonders wertvoll , um die kritischen frühen Entscheidungen zur Information: die Verabreichung Gewebe – Plasminogen – Aktivator (tPA) für die Thrombolyse und / oder Selektierung endovaskuläre Gerinnsel-Retrieval – ^2. Strom CT-basierten Thrombus-Bildgebung kann jedoch nicht seriell verfolgen cerebral Thromboembolien in vivo, da es indirekte Methoden verwendet Thromben zu demonstrieren: nach Kontrastierung des Blut – Pool von jodhaltigen Kontrast werden die Thromben nachgewiesen als Defekte in den Gefäßen zu füllen. Es gibt Dosisgrenzwerte und Risiken im Zusammenhang mit der wiederholten Gabe von jodhaltigen Kontrast, die Abbildung von Thromben auf diese Weise wiederholt nicht aus.

Somit besteht ein kritischer Bedarf an einem direkten Abbildungsmethodik für zerebrale Thromben bei Schlaganfall-Patienten, zu ermöglichen schnellere und bessere Behandlungsentscheidungen getroffen werden. Wir schlagen vor, um dies zu erreichen, indem der Wert von CT Verbesserung der derzeit verwendeten Front Bildgebungsmodalität für Schlaganfall, bei der Verwendung eines Thrombus such nanopartikuläre molekularen Bildgebungsmittel.

Wir haben die Verwendung dieses Mittels mit Mikro-Computertomographie (microCT) gezeigt, ein hochauflösendes ex vivo oder in vivo (kleines Tier) -Abbildung Version von CT, die eine schnelle Datenerfassung ermöglicht <sup> 3,4. Auch mit der relativ schlechten Weichteilkontrast für Kleintier microCT (viel schlechter als die von menschlichen Größe Scanner), war das Bildgebungsmittel und Thromben zu suchen können, markieren, indem sie hochdichtem Fliess auf CT machen, ein "dichtes Gefäß Zeichen" durch molekulare verbessert Bildgebung.

Ergänzt wird das CT – Technik hat sich unsere Gruppe entwickelt zuvor eine optische direkten Thrombus Imaging – Technik unter Verwendung von Cy5.5 Nah-Infrarot – Fluoreszenz (NIRF) Sonde zerebralen Thrombus Last ⁵ zu visualisieren. Dies ist ein Ex – vivo – Technik , die auf post mortem Gehirnen, aber ist sehr empfindlich, und dient in – vivo – Daten in der Forschung Einstellung zu bestätigen.

CT und NIRF basierten Thrombus suchBildgebungsTechniken Nachdem ermöglicht es uns, diese Techniken zu vergleichen und sehr informative Daten über die Rolle des Thrombus und Thrombus-Bildgebung in den Prozess des ischämischen Schlaganfalls Entwicklung zu erreichen.

Here beschreiben wir ein detailliertes Protokoll einer kombinierten Technik der in vivo und ex vivo microCT NIRF Bildgebung direkt Thromboembolien in einem Mausmodell der embolischen Schlaganfall zu visualisieren. Diese einfache und robuste Methoden sind nützlich , unser Verständnis von thrombotischen Erkrankungen voranzubringen , indem ermöglicht die genaue In – vivo – Beurteilung von Thromben Belastung / Verteilung und Charakterisierung der dynamischen Thrombus Evolution in einer raschen und quantitativen Weise in vivo während der Therapie, gefolgt von Ex – vivo – Daten , die dazu dient als Kontrolle und Referenz – Standard für den Nachweis der in vivo – Bildgebung Befunde.

Protocol

Alle Tier Verfahren in diesem Protokoll demonstriert wurden von der Dongguk Universität Ilsan Krankenhaus Animal Care und Use Committee und durchgeführt in Übereinstimmung mit den Grundsätzen und Verfahren der Beschreibung in der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren überprüft und genehmigt. 1. Herstellung von exogen Formed Clot Beschriftet mit Fluoreszenzmarker (Abbildung 1) Anästhesieren eine Maus in einer Induktionskammer unter Verwendung von 3% Isofluran mit 30% Sauerstoff…

Representative Results

Baseline microCT Bilder, in vivo , erhalten nach Verabreichung fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 & mgr; l) bei 1 h nach embolischen Schlaganfall, deutlich zerebralen Thrombus im MCA visualisiert – ACA Bifurkation Bereich des distalen Arteria carotis interna (Abbildung 6 ). Follow-up microCT Bildgebung zeigte keine Veränderung in der COW Thrombus mit Salzbehandlung. Die Behandlung mit tPA zeigte eine allmähliche Auflösung des Thrombus COW (blaue Pfeile in <stro…

Discussion

Wir haben gezeigt , die Verwendung von zwei komplementären molekularen Bildgebungstechniken für die direkte Abbildung von Thromben in experimentellen Modellen der embolischen Schlaganfall: eine Fibrin- Goldnanopartikel gezielte (fib-GC-AuNP) für in vivo microCT basierte Abbildungs und eine FXIIIa gezielte optische Abbildungssonde zur ex vivo Fluoreszenz – Bildgebung.

Nach intravenöser Verabreichung von fib-GC-AuNPs wurde Thromben sichtbar CT als dichte Strukturen, verur…

Materials

Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
Image J software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 mL