Denne modifiserte utvinning protokollen forbedrer RNA og DNA-utbytte fra en mer målrettet regioner av interesse i histopatologiske vevsblokker.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
Genomisk biomarkør forskning søker å identifisere molekylære korrelater som nøyaktig og pålitelig reflekterer sykdomsstatus, og gjøre det i en klinisk nyttig måte. 1 Biomarker utvikling er avhengig av retrospektiv analyse av godt kommenterte vevsprøver. Syke og normale vevsprøver lagres enten som fersk frosset vev i spesialiserte biobanker eller som formalinfiksert parafin-embedded tissue (FFPET) blokker i kliniske arkiver. Fersk frosset vev åpner for utvinning av høykvalitets nukleinsyrer og har vært mye brukt i genomisk biomarkører studier. 2,3 Men færre vevsprøver er tilgjengelig i biobanker og studere slikt vev introduserer en bias mot større prøver, uvanlige kategorier av sykdom, og pasienter sett på spesialiserte sentre med større evner til bank vev. 4 FFPET, i kontrast, er standard lagringsmetode for syke mennesker og dyr vev. Mens FFPET blokkene opprettholde cellulære morphology, fiksering prosess kryssbindinger andre cellulære bestanddeler til nukleinsyrer. Tverrbundet RNA og DNA er gjenvinnbart, men bare i degraderte, sterkt fragmenterte former. 5,6 Imidlertid er disse DNA- og RNA-fragmenter er mottagelig for analyse av en voksende rekke analyser, inkludert mRNA-ekspresjon, DNA hypermethylation, og målrettet sekvensering. 7,8 for å utnytte denne muligheten i den store mengde og utvalg av FFPET tilgjengelig for forskning, er det behov for en effektiv og pålitelig utvinning protokollen.
En stor andel av biomarkør forskning i vev fokuserer på kreft. I likhet med andre typer sykt vev, viser kreftvev ofte betydelig regional heterogenitet i celle bevaring og celletype. Etter biomarkør forskning avhengig av evnen til å korrelere bestanddeler av sykt vev med molekylære egenskaper, et kritisk trinn i denne prosessen er den presise høsting av vev som er godt bevart og anriket på disease under studien. I FFPET er to berikelse teknikker ofte benyttet: laser capture mikrodisseksjon (LCM), og mikrotom snitting. LCM muliggjør sterkt fokusert vev høsting og kan brukes til å isolere bestemte og godt bevarte celletyper i heterogene vev. 9,10 Imidlertid krever LCM kostbart utstyr og uforholdsmessig tidkrevende for et stort antall prøver. Mikrotom seksjonering er et mer allment brukt prosess hvor tynne snitt er kuttet fra FFPET blokker. 11,12 mikrotom-kutt seksjoner ofte inkluderer vev som er heterogene i celle bevaring (f.eks nekrotisk vs. godt bevart) og sammensetning (f.eks kreft vs benign parenchyma), og kan følgelig føre til homogenisering av molekylære egenskaper beste undersøkt hver for seg. Det er således et behov for en høy gjennomstrømning metode som beriker for celler av interesse. En tredje metode, isolering av nukleinsyrer fra FFPET kjerner, dette berikelse, er egnet for høy throughput protokoller, og har blitt brukt av andre til å isolere RNA eller DNA fra forskjellige vev kjerner. 7,13,14
Et antall publiserte protokoller spesifiserer fremgangsmåter for ekstrahering av nukleinsyrer fra FFPET (tabell 1). Men protokoller hvor RNA og DNA er hentet fra samme vev har blitt optimalisert for mikrotom vevssnitt, men ikke for vev kjerner. 15,16 Tilsvarende publiserte protokoller som gir økt vev spesifisitet, enten gjennom vev kjerner eller lysbilde microdissections, angir prosedyrer for ekstraksjon av DNA, men ikke RNA. 7,17 her, en optimalisert protokoll for dual ekstraksjon av både DNA og RNA fra samme vev kjernen er demonstrert. Tissue kjerner høstes ved å sette inn vev microarray (TMA) stempel inn i regioner av interesse kartlagt på FFPET blokker. Kartleggingen utføres ved å annotere et objektglass med en merkepenn og overføring av anmerkningen til overflaten av den tilsvarende FFPET blokken (figur 1).
Tidligere arbeid som førte til utviklingen av denne protokollen, inkludert en sammenligning av flere kommersielt tilgjengelige nukleinsyre utvinning systemer. I denne sammenligningen modifikasjoner til kommersielle protokoller, slik det er beskrevet nedenfor gitt den høyeste DNA- og RNA-avkastning og kvalitet (Selvarajah et al., In prep). Tissue kjerner er tykkere enn 5-10 um micron seksjoner som vanligvis brukes i FFPET ekstraksjonsmetoder 11,12,14,18 – 20, og kan inneholde flere variable mengder parafin. For å kompensere for dette, deparaffinization ble forbedret ved å gjenta xylen og etanol behandlinger, og ved å innføre en motorisert homogenisering trinn (figur 1). Videre ble proteinase K fordøyelsen ganger forlenget for å øke DNA utbytte. Totalt sett er denne protokollen kostnadseffektiv og muliggjør etablering av sammenhengene mellom molekylære og histopatologiske trekk ved sykdom i large, godt karakteriserte populasjoner. Protokollen som i sin helhet kan utføres på en pålitelig måte i løpet av 2 dager, inkludert 3 timer av praktisk tid, med lite behov for spesialisert eller kostbart utstyr.
Trinn-for-trinn-protokollen er heretter som en modifisert versjon av produsentens protokoll. 21 Vennligst se tabell for material / Utstyr for spesifikke reagenser, utstyr og produsenter.
For vellykket utvinning av DNA og RNA fra vev regioner av interesse, er nøyaktig kjerneboring kritisk. Denne protokollen beskriver bruk av en vev slag for å isolere 0,6 mm diameter kjerne og en oversikt over prosessen for overføring av notasjoner fra objektglass til tilsvarende FFPET blokker. Modifikasjoner til produsentens protokoll ble pålagt å effektivt pakke nukleinsyrer fra kjerner, som er ca 50 ganger tykkere enn mikrotom seksjoner som protokollen ble beregnet. Ettersom kjernene kan inneholde mer parafinvoks i forhold til vevssnitt, effektiv deparaffinization ledere gjennom gjentatte xylen og etanol behandlingstrinn var nødvendig. Suksessen til etter deparaffinization trinn avhengig av riktig mekanisk vev kjerner homogenisering og effektiv proteinase K fordøyelsen. Ytterligere optimalisering av proteinase K-fordøyelse kan utføres.
Det er verdt å nevne at denne metoden identifisertfies områder av interesse på overflaten av blokken, som er identifisert på tilsvarende histopatologiske lysbilder. Som kjerne avlinger vev som kan være 3 eller 4 mm dypt, kan brukere av denne protokollen være bekymret for hva celler eller vev lå under blokken overflaten. Selv om dette er en gyldig bekymring, har flere studier (anmeldt i referanse 27) viste at vevet kjerner trofast representerer histologisk og molekylære funksjoner av patologiske vevsblokker, spesielt når duplikat eller tredoble kjerner er samplet fra området av interesse.
Som det modifiserte kommersiell utvinning kit innført i denne protokollen muliggjør samtidig ekstraksjon av både DNA og RNA fra samme vev, lagrer protokollen verdifulle biologiske materialet og tillater en direkte sammenligning mellom de to resulterende nukleinsyrene fra den samme prøven. Samtidig utvinning av RNA og DNA kutter ned arbeidskraft og vev utarming til det halve, og gjør det mulig presis integrert analyse av gen expression, samt epigenetiske og genetiske egenskaper som finnes i DNA. Da utbyttene av både RNA og DNA fra disse representative vev kjernene typisk overstige 600 og 300 ng, henholdsvis, og siden de fleste aktuelle PCR og sekvense neste generasjon anvendelser krever typisk 10-100 ng, bør de fleste prøvene renset ved denne protokollen gir tilstrekkelig materiale for flere nedstrøms analyser. Denne protokollen har vist seg å være reproduserbar på tvers av uavhengige laboratorier (Selvarajah et al., In prep.). RNA fra denne protokollen var av tilstrekkelig kvalitet for analyse av genuttrykk ved hjelp av enten RT-PCR eller en populær multianalyte plattform, og DNA resultater i metylering spesifikke PCR-analyser. Fremtidige studier med sikte på å vurdere nytten av gjenopprettede nukleinsyrer i neste generasjons sekvensering er garantert.
Dermed ble flere endringer gjort til en kommersielt tilgjengelig protokoll, beregnet for tynne FFPET seksjoner, som gjør det egnet for co-ekstrahering av RNA og DNA fra 0,6 mm FFPET kjerner. Protokollen tydelig vist høye utbytter i en stor kohort av prostatakreft prøver og i et begrenset sett av prøver fra kreft i bryst, hjerne og blære. Samlet sett protokollen bør det mulig for brukere å utføre målrettede gen-baserte analyser av store godt kommenterte vev samlinger. Det viktigste er at protokollen effektiv fokusert prøvetaking av regioner av interesse i FFPET, relativt lite hands-on tid, og høy nok avkastning for de fleste nedstrømsapplikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |