इमेजिंग एकल कोशिका संकल्प पर भ्रूण और प्रसव के बाद दिल को मंजूरी दे दी
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
पूरे दिल स्तर पर एकल प्रतिरूप ट्रेसिंग और विश्लेषण हृदय विकास के दौरान हृदय पूर्वज सेल व्यवहार और भेदभाव का निर्धारण, और सामान्य और असामान्य हृदय morphogenesis के सेलुलर और आणविक आधार के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते हैं। पूर्वव्यापी एकल प्रतिरूप विश्लेषण के हाल उभरती प्रौद्योगिकियों एकल कक्ष संकल्प पर हृदय morphogenesis के अध्ययन संभव बनाते हैं। हालांकि, ऊतक अस्पष्टता और इमेजिंग गहराई के रूप में दिल की रोशनी बिखरने एकल कक्ष संकल्प पर बाधा पूरे दिल इमेजिंग बढ़ जाती है। इन बाधाओं, एक पूरे भ्रूण समाशोधन प्रणाली है कि दिल दोनों रोशनी और पता लगाने के लिए अत्यधिक पारदर्शी विकसित किया जाना चाहिए प्रदान कर सकते हैं काबू पाने के लिए। सौभाग्य से, पिछले कई वर्षों में, इस तरह की स्पष्टता के रूप में पूरे जीव समाशोधन प्रणाली, SCA ले, SeeDB, ClearT, 3DISCO, घन, DBE, BABB और संधि के लिए कई तरीके सूचित किया गया है। इस प्रयोगशाला कार्ड के सेलुलर और आणविक तंत्र में रुचि रखता हैआईएसी morphogenesis। हृदय के विकास के दौरान कम लेबल कोशिकाओं को ROSA26-कंफ़ेद्दी प्रणाली, हाल ही में, हम एकल कोशिका वंश ROSA26-CRE ERT2 के माध्यम से अनुरेखण की स्थापना की। हम पूरे माउंट धुंधला दिल के अंदर छवि एकल क्लोन करने के साथ संयोजन में भ्रूण स्पष्ट को एससीए le और घन (स्पष्ट है, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण) सहित कई पूरे भ्रूण-समाशोधन के तरीके में रूपांतरित किया। दिल सफलतापूर्वक एकल कक्ष संकल्प पर imaged किया गया था। हमने पाया है कि SCA ले भ्रूण दिल साफ कर सकते हैं, लेकिन प्रभावी ढंग से प्रसव के बाद दिल को साफ नहीं किया जा सकता है, जबकि घन प्रसव के बाद दिल साफ कर सकते हैं, लेकिन नुकसान ऊतक भंग द्वारा भ्रूण दिल। यहाँ वर्णित विधियों हृदय morphogenesis, जो, बारी में, जन्मजात हृदय दोष के सेलुलर और आणविक आधार प्रकट कर सकते हैं के दौरान एक भी क्लोन संकल्प पर जीन समारोह के अध्ययन की अनुमति होगी।
Introduction
कार्डिएक morphogenesis एक अनुक्रमिक घटना है कि दिल के विशिष्ट क्षेत्रों में हृदय पूर्वज कोशिकाओं के चार अलग अलग प्रकार के spatiotemporal संगठन की आवश्यकता है, और यह भी इस प्रक्रिया आर्केस्ट्रा कार्यात्मक दिल 1,2 फार्म करने के लिए कई आनुवंशिक विनियामक नेटवर्क की आवश्यकता है। कार्डिएक विनिर्देश, भेदभाव, patterning, और चैम्बर परिपक्वता हृदयजनित प्रतिलेखन कारक 3 द्वारा विनियमित रहे हैं। आनुवंशिक उत्परिवर्तन या हृदय पूर्वज कोशिकाओं में इन कारकों में से posttranscriptional विपथन या तो भ्रूण मारक या जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) 4 में परिणाम सकता है। हृदय morphogenesis के अध्ययन के तीन आयाम (3 डी) में निहित संरचनात्मक विवरण और एकल लेबल हृदय पूर्वज सेल वंश हृदय विकास के दौरान अनुरेखण हृदय morphogenesis की समझ को बढ़ावा देंगे की एक समझ की आवश्यकता है। उच्च संकल्प खंड आधारित टोमोग्राफी तरीकों की एक संख्या वीं में विकसित किया गया हैअतीत की छवि अंग संरचना 5,6 करने के लिए कुछ दशकों ई; हालांकि, इन तरीकों महंगा, विशेष उपकरणों, व्यापक श्रम की आवश्यकता होती है, और एकल कक्ष के प्रस्ताव पर विस्तृत संरचनात्मक संगठन की कमी में अंतिम बड़ा छवि 7.8 खंगाला।
एकल कोशिका के स्तर पर 3 डी इमेजिंग बड़ा विवो 7 में पूर्वज सेल भेदभाव और सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक प्रकाश बिखरने 3 डी में कोशिकाओं और संरचनाओं इमेजिंग गहरी बरकरार दिल के अंदर करने के लिए प्राथमिक बाधा बनी हुई है। लिपिड प्रकाश बिखरने का एक प्रमुख स्रोत है, और लिपिड और / या लिपिड और उनके आसपास के क्षेत्रों के बीच अपवर्तनांक अंतर का समायोजन को हटाने के हैं ऊतक पारदर्शिता 8 बढ़ाने के लिए संभावित दृष्टिकोण हैं। पिछले कई वर्षों में, ऊतक समाशोधन तरीकों की एक संख्या विकसित किया गया है, जो ऊतक अस्पष्टता और रोशनी बिखरने को कम करने, BABB (बेंजाइल अल्कोहल और लोबान benzoat की तरहई मिश्रण) और DBE (tetrahydrofuran और dibenzylether); लेकिन इन तरीकों में, प्रतिदीप्ति शमन एक मुद्दा 8-10 बनी हुई है। विलायक आधारित ऐसी SeeDB (फ्रुक्टोज / thioglycerol) और 3DISCO (क्लोराइड / dibenzylether) के रूप में हाइड्रोफिलिक तरीकों, फ्लोरोसेंट संकेतों की रक्षा, लेकिन पूरे अंग पारदर्शी 7,8,11 प्रस्तुत करना नहीं है। इसकी तुलना में, स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि अंग पारदर्शी renders, लेकिन यह लिपिड 8,12 दूर करने के लिए एक विशेष वैद्युतकणसंचलन डिवाइस की आवश्यकता है, संधि (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक) है, जो भी हाइड्रोजेल embedding 7,13 आवश्यकता के रूप में करता। सभी उपलब्ध ऊतक समाशोधन के तरीकों के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, रिचर्डसन और Lichtman, एट अल में 1 टेबल को देखें। 7।
2011 में, हामा एट अल। Serendipitously एक हाइड्रोफिलिक मिश्रण 'SCA ले' की खोज (यूरिया, ग्लिसरीन और ट्राइटन X-100 मिश्रण) माउस मस्तिष्क और भ्रूण Transpar कि rendersईएनटी, जबकि पूरी तरह से लेबल क्लोन 14 से फ्लोरोसेंट संकेतों के संरक्षण। यह एक subcellular संकल्प पर कई मिलीमीटर और neuronal आबादी और अनुमानों का बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण की गहराई पर बरकरार मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। Susaki एट अल। आगे SCA ले सुधार किया aminoalcohols जोड़कर और 'घन' (स्पष्ट, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण) ऊतक समाशोधन विधि है, जो फॉस्फोलिपिड solubilization में वृद्धि हुई है, कम समाशोधन समय विकसित की है, और बहुरंगा फ्लोरोसेंट इमेजिंग 8 के लिए अनुमति दी। वर्तमान अध्ययन में, कार्डियोजेनेसिस दौरान दिल के अंदर SCA ले के लाभ और घन ऊतक समाशोधन तकनीक और उच्च संकल्प 3 डी ऑप्टिकल सेक्शनिंग, व्यक्तिगत क्लोन लेने के Rosa26Cre ERT2 15, R26R-कंफ़ेद्दी 16, αMHC-Cre 17, cTnT-CRE का उपयोग कर पता लगाया गया 18, </strong> Nfatc1-Cre 19, और Rosa26-mTmG (mTmG) 20 माउस लाइनों। विधि पूरे माउंट धुंधला (WMS) के संयोजन ऊतक समाशोधन तरीकों आगे लेबल क्लोन में अन्य प्रोटीन का धुंधला के लिए और एक 3 डी बड़ा संदर्भ में उनके व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति के साथ पहले से 21,22 विकसित की है। ऊतक समाशोधन और WMS के संयोजन हृदय विकास के दौरान विभिन्न जीन और प्रोटीन की भूमिका को बेहतर ढंग से समझ, और जन्मजात हृदय दोष के एटियलजि के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान अन्य पूर्वज सेल भेदभाव, सेलुलर व्यवहार, और अंग morphogenesis घटनाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूण अलगाव में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। E9.5 भ्रूण बहुत नाजुक है और आकार में छोटे हैं, इसलिए अतिरिक्त देखभाल अलगाव के दौरान भ्रूण / दिल संरचनाओं को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। गैर-भ्रूण अतिरिक्त भ्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
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