Очищенные визуализации эмбрионального и постнатального Сердца в одноклеточные Разрешение
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Одно клоновая трассировка и анализ на уровень целого сердца может определить сердечный поведение и дифференцировку клеток-предшественников во время развития сердца, а также позволяют при изучении клеточной и молекулярной основе нормальных и ненормальных сердечной морфогенеза. Последние новые технологии ретроспективных отдельных клоновых анализов делают исследование сердца формообразования при разовом разрешении клеток осуществимо. Однако непрозрачности ткани и рассеяние света сердца как глубина изображения увеличивается Hinder визуализации целого сердца в одной резолюции клетки. Для преодоления этих препятствий, клиринговую систему целого эмбриона, который может оказывать сердце высоко прозрачной как для освещения и обнаружения должны быть разработаны. К счастью, в последние несколько лет, было зарегистрировано много методик для целого организма клиринговых систем , таких как CLARITY, Sca ле, SeeDB, ClearT, 3DISCO, кубические, DBE, Бабб и ПАКТ. Эта лаборатория заинтересована в клеточных и молекулярных механизмов картыIAC морфогенез. Недавно мы установили одноклеточной родословие трассировку через ROSA26-Cre ERT2; система ROSA26-конфетти , чтобы разреженно клеток меток во время развития сердца. Мы адаптировали несколько целых эмбрионов очистив методик , включая Sca ле и кубика (четкое, беспрепятственное коктейлей изображения мозга и компьютерного анализа) , чтобы очистить эмбрион в сочетании с целой горы окрашиванием к изображению отдельных клонов внутри сердца. Сердце было успешно отображены в одной резолюции ячейки. Мы обнаружили , что Sca ле может очистить эмбриональное сердце, но не может эффективно очистить послеродовую сердце, в то время как CUBIC может очистить послеродовую сердце, но повреждает эмбриональные сердце путем растворения ткани. Методы, описанные здесь, позволят исследование функции генов в одном разрешении клона во время остановки морфогенеза, который, в свою очередь, может выявить клеточные и молекулярные основы врожденных пороков сердца.
Introduction
Сердечный морфогенез является последовательное событие , которое требует пространственно – временной организации четырех различных типов сердечных клеток – предшественников в различных секторах сердца, а также требует множественных генетических регуляторных сетей , чтобы организовать этот процесс для формирования функционального сердца 1,2. Сердечный спецификация, дифференцировка, структурирование, и камера Созревание регулируются кардиогенных транскрипционных факторов 3. Генетическая мутация или посттранскрипционная аберрация этих факторов в сердечных клеток – предшественников может привести либо к эмбриональной летальности или врожденных пороков сердца (ИБС) 4. Изучение сердечной морфогенеза требует понимания присущих структурных деталей в трех измерениях (3D) и одного меченого сердца клеток-предшественников линии отслеживании во время развития сердца будет способствовать пониманию сердечной морфогенеза. Ряд секций на основе методов томографии с высокой разрешающей способностью были разработаны в гое за последние несколько десятилетий в структуре 5,6 органа изображения; Однако эти методы требуют дорогие специализированные инструменты, обширный труд, и не хватает подробной структурной организации в одной резолюции ячейки в финале объемное изображение реконструировано 7,8.
3D объемные изображения на уровне одной клетки обеспечивает средство для изучения дифференцировки клеток – предшественников и клеточного поведения в естественных условиях 7. Тем не менее, рассеяние света ткани остается основным препятствием для визуализации клеток и структур в 3D глубоко внутри интактного сердца. Липиды являются основным источником рассеяния света, а также удаление липидов и / или корректировки разности показателей преломления между липидами и окружающих их областей являются потенциальными подходы к повышению прозрачности ткани 8. За последние несколько лет, был разработан ряд методов клиринговых ткани, которые уменьшают прозрачность ткани и рассеяние света, как Бабб (бензиловый спирт и бензиловый бензоате смеси) и DBE (тетрагидрофуран и dibenzylether); но в этих методах, тушение флуоресценции остается проблемой 8-10. Растворитель на основе гидрофильных методы, такие как SeeDB (фруктоза / тиоглицерин) и 3DISCO (дихлорметан / dibenzylether), сохраняют флуоресцентные сигналы, но не оказывают весь орган прозрачный 7,8,11. Для сравнения, метод ЯСНОСТЬ ткани клиринговые делает орган прозрачным, но это требует специализированного устройства электрофореза для удаления липидов 8,12, как это делает ПАКТ (пассивная техника ясности), что также требует гидрогель вложения 7,13. Для получения более подробной информации о всех доступных методов тканевой очистки, обратитесь к таблице 1 в Ричардсона и Лихтман и др. 7.
В 2011 году , Хама и др. Обнаружили по счастливой случайности гидрофильную смесь 'Le SCa фирмы ' (мочевина, глицерин и тритон Х-100 смесь) , что делает мозг мыши и зародыша transparлор при полном сохранении флуоресцентные сигналы от меченных клонов 14. Это позволяет визуализации интактного мозга на глубине нескольких миллиметров и крупномасштабной реконструкции нейрональных популяций и прогнозов на субклеточном резолюции. Susaki и др. дальнейшее улучшение Sca ле путем добавления аминоспирты и разработал 'КУБИЧЕСКИЕ' (четкое, беспрепятственное коктейли визуализации мозга и компьютерного анализа) способ очистки ткани, что позволило увеличить фосфолипидов солюбилизации, сокращение времени клиринговую и позволило многоцветной флуоресцентной визуализации 8. В настоящем исследовании, воспользовавшись Sca ле и кубические методы клиринговых ткани и высокое разрешение 3D оптический секционирования, отдельные клоны внутри сердца во время кардиогенеза были прослежены с помощью Rosa26Cre ERT2 15, R26R-конфетти 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> Nfatc1-Cre 19 и Rosa26-mTmG (mTmG) 20 линий мыши. Сочетание метода целом крепление окрашивание (WMS) разработан ранее 21,22 с тканевых методами клиринговых далее разрешенное для окрашивания других белков в маркированных клонов и для изучения их поведения в 3D – мерную контексте. Сочетание очистки ткани и ЗЦМ позволяет для лучшего понимания роли различных генов и белков во время развития сердца и этиологии врожденных пороков сердца. Этот протокол может быть применен для изучения другой дифференцировки клеток-предшественников, клеточного поведения и органа морфогенеза события в процессе разработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение эмбриона является очень важным шагом. E9.5 эмбрионов очень хрупкие и небольшие по размеру, поэтому дополнительные следует позаботиться, чтобы не повредить структуры эмбриона / сердца во время изоляции. Не связанные с эмбриональными дополнительные слои, огибающие эмбриона / се?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
