Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Enkelt klonal opsporing og analyse på hel-hjerte niveau kan bestemme cardiac progenitorcelle adfærd og differentiering under hjerte- udvikling, og giver mulighed for undersøgelse af cellulære og molekylære grundlag for normal og unormal hjertefunktion morfogenese. Nylige nye teknologier af retrospektive enkelt klonale analyser gøre studiet af hjerte morfogenese på enkelt celle opløsning muligt. Imidlertid er vævet opacitet og lysspredning af hjertet som billeddannende dybde forøget hindre hel-afbildning af hjertet ved enkelt celle opløsning. For at overvinde disse forhindringer, en hel-foster clearingsystem, der kan gøre hjerte meget gennemsigtigt for både belysning og detektion skal udvikles. Heldigvis i de sidste mange år, er blevet rapporteret mange metoder til hel-organisme clearingsystemer såsom CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb og PACT. Dette laboratorium er interesseret i de cellulære og molekylære mekanismer i kortIAC morfogenese. For nylig har vi etableret enkelt celle afstamning sporing via ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Confetti system tyndt label celler under hjerte-udvikling. Vi tilpassede flere hele embryo-clearing metoder herunder Sca le og CUBIC (klare, uhindret hjerne imaging cocktails og beregningsmæssige analyse) for at rydde embryo i kombination med hele mount farvning til billedet enkelte kloner inde i hjertet. Hjertet blev succesfuldt afbildet ved enkelt celle opløsning. Vi fandt, at SCA le kan rydde embryoniske hjerte, men kan ikke effektivt fjerne den postnatale hjerte, mens CUBIC kan rydde postnatale hjerte, men skader den embryoniske hjerte ved at opløse vævet. De her beskrevne metoder vil tillade undersøgelse af genfunktion i en enkelt klon beslutning under cardiac morfogenese, hvilket igen kan afsløre den cellulære og molekylære grundlag for medfødte hjertefejl.
Introduction
Cardiac morfogenese er en sekventiel begivenhed, der kræver Spatiotemporal organisering af fire forskellige typer af hjerte-stamceller i forskellige sektorer af hjertet, og også kræver flere genetiske regulerende net at orkestrere denne proces til at danne den funktionelle hjerte 1,2. Cardiac specifikation, differentiering, mønster, og kammer modning reguleres af cardiogene transkriptionsfaktorer 3. Genetisk mutation eller posttranskriptionel aberration af disse faktorer i hjerte-stamceller kan resultere i enten embryonale letalitet eller medfødte hjertefejl (CHD) 4. Studiet af hjerte morfogenese kræver en forståelse af iboende strukturelle detaljer i tre dimensioner (3D) og enkelt mærkede hjerte-stamcelle afstamning sporing under hjerte-udvikling vil fremme forståelsen af hjerte-morfogenese. En række høj opløsning sektion baseret tomografi metoder er blevet udviklet i the fortid årtier til billedet orgel struktur 5,6; men disse metoder kræver dyre, specialiserede instrumenter, omfattende arbejdskraft, og mangler detaljeret strukturel organisation på enkelt celle opløsning i det endelige volumetriske rekonstruerede billede 7,8.
3D volumetriske billeddannelse på enkelt celle niveau giver et middel til at studere progenitorcelle differentiering og cellulære adfærd in vivo 7. Imidlertid væv lysspredning fortsat den primære hindring for billeddannelse celler og strukturer i 3D dybt inde det intakte hjerte. Lipider er en væsentlig kilde til lysspredning, og fjernelse af lipider og / eller justering af forskellen i brydningsindeks mellem lipider og de omkringliggende områder er potentielle metoder til forøgelse af væv gennemsigtighed 8. I de sidste mange år, blev en række væv clearing metoder udviklet, som reducerer væv opacitet og lysspredning, ligesom Babb (benzylalkohol og benzyl benzoate blanding) og DBE (tetrahydrofuran og dibenzylether); men i disse fremgangsmåder, fluorescensslukning stadig et problem 8-10. Opløsningsmidlet baseret hydrofile metoder, såsom SeeDB (fruktose / thioglycerol) og 3DISCO (dichlormethan / dibenzylether), bevare fluorescerende signaler, men ikke gør det hele orgel gennemsigtig 7,8,11. Til sammenligning CLARITY væv-clearing metode gør organet transparent, men det kræver en specialiseret elektroforeseapparat at fjerne lipider 8,12, ligesom PACT (passiv klarhed teknik), hvilket også kræver hydrogel indlejring 7,13. For detaljerede oplysninger om alle tilgængelige væv-clearing metoder, se tabel 1 i Richardson og lichtman, et al. 7.
I 2011 Hama et al. Serendipitously opdaget en hydrofil blanding 'Sca le' (urinstof, glycerol og Triton X-100-blanding), der gør muse hjerne og embryo genneent samtidig helt bevare fluorescerende signaler fra mærkede kloner 14. Dette giver mulighed for billeddannelse af den intakte hjerne i en dybde på flere millimeter og genopbygning af neuronale populationer og fremspring storstilet ved en subcellulær opløsning. Susaki et al. yderligere forbedret Sca le ved at tilføje aminoalkoholer og udviklet den "CUBIC '(klare, uhindret hjerne imaging cocktails og beregningsmæssige analyse) væv clearing metode, der steg phospholipid solubilisering, reduceret clearing tid, og tilladt for flerfarvet fluorescerende billeddannelse 8. I den foreliggende undersøgelse, at drage fordel af Sca le og CUBIC væv clearing teknikker og høj opløsning 3D optisk sektionering, individuelle kloner inde i hjertet under cardiogenese blev sporet ved hjælp Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> Nfatc1-Cre 19, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer. Kombinationen af hele mount farvning (WMS) metode udviklet tidligere 21,22 med væv clearing metoder længere tillades til farvning af andre proteiner i mærkede kloner og til undersøgelse af deres adfærd i en 3D volumetrisk kontekst. Kombinationen af væv clearing og WMS giver mulighed for en bedre forståelse af de roller forskellige gener og proteiner i løbet hjerte-udvikling, og ætiologien af medfødte hjertefejl. Denne protokol kan anvendes til at studere andre progenitorceller differentiering, cellulær adfærd, og orgel morfogenese hændelser under udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embryo isolation er en meget kritisk trin. E9.5 embryoer er meget skrøbelige og lille i størrelse, så ekstra pleje skal tages på ikke at beskadige embryo / hjerte strukturer under isolation. De ikke-embryonale ekstra lag omsluttende embryo / hjerte bør fjernes omhyggeligt, især når billeddannelse hele embryo. Dette giver mulighed for blanding antistof og clearing penetration dybt inde i de embryonale væv, og også hjælper med at fjerne baggrunden signal, når billeddannelse. Flere antistoffer, herunder antistof…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
