Diagnostikk klarert Embryonic og barsel hjerter på Single-celle Oppløsning
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Enkelt klonal sporing og analyse ved hel-hjertenivå kan bestemme hjertestamcelle oppførsel og differensiering i løpet av hjerte-utvikling, og tillate for studium av den cellulære og molekylære grunnlaget for normal og unormal hjerte morfogenese. Siste nye teknologier av retrospektive enkelt klonal analyser gjøre studiet av hjerte morphogenesis på enkelt celle oppløsning gjennomførbart. Imidlertid er vevet opasitet og lysspredning i hjertet som avbildningsdybden økes hindre hel-hjerteavbildning ved enkelt celle oppløsning. For å overvinne disse hindringene, en hel-embryo clearing system som kan gjengi hjerte svært oversiktlig for både belysning og deteksjon må utvikles. Heldigvis, i de siste årene, mange metoder for hel-organisme avregningssystemer som CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, og babb PACT er rapportert. Dette laboratoriet er interessert i de cellulære og molekylære mekanismer for kortIAC morphogenesis. Nylig etablerte vi enkelt celle avstamning sporing via ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Konfetti system til tynt label celler under hjerte utvikling. Vi tilpasset flere hele embryo-clearing metoder inkludert Sca le og CUBIC (klar, uhindret hjernen imaging cocktails og beregningsorientert analyse) for å fjerne fosteret i kombinasjon med hele mount flekker til bildeenkelt kloner inne i hjertet. Hjertet ble vellykket avbildes på enkelt celle oppløsning. Vi fant at Sca le kan fjerne embryonale hjertet, men kan ikke effektivt fjerne postnatal hjertet, mens CUBIC kan tømme postnatal hjertet, men skader embryonale hjertet ved å løse opp vevet. Metodene som beskrives her, vil muliggjøre studier av genfunksjon ved en enkelt klon oppløsning i løpet av hjerte-morfogenese, som i sin tur kan avsløre den cellulære og molekylære basis av medfødt hjertefeil.
Introduction
Cardiac morphogenesis er en sekvensiell hendelse som krever tid og rom organiseringen av fire ulike typer hjerte stamceller inn i forskjellige deler av hjertet, og også krever flere genetiske regulatoriske nettverk for å organisere denne prosessen for å danne funksjonelle hjerte 1,2. Cardiac spesifikasjon, differensiering, mønster, og kammer modning er regulert av kardiotranskripsjonsfaktorer 3. Genetisk mutasjon eller posttranskripsjonelt avvik av disse faktorene i hjerte stamceller kan resultere i enten embryonale dødelighet eller medfødte hjertefeil (CHD) 4. Studiet av hjerte morphogenesis krever en forståelse av iboende strukturelle detaljer i tre dimensjoner (3D) og enkelt merket hjertestamcelle avstamning tracing under hjerte utvikling vil fremme forståelsen av hjerte morphogenesis. En rekke høyoppløste seksjonsbasert tomografi metoder har blitt utviklet i the siste tiårene til bilde organ struktur 5,6; Men disse metodene krever dyre, spesialiserte instrumenter, omfattende arbeid, og mangler detaljert strukturell organisasjon på enkelt celle oppløsning i det endelige volumetriske rekonstruert bilde 7,8.
3D volumet bildebehandling på celle-nivå gir et middel for å studere stamceller differensiering og cellulær oppførsel in vivo 7. Men vev lysspredning fortsatt den primære hinderet for å avbilde celler og strukturer i 3D dypt inne i intakt hjerte. Lipider er en viktig kilde for lysspredning, og fjerning av lipidene og / eller justering av brytningsindeksforskjellen mellom lipider og deres omkringliggende områder er mulige fremgangsmåter for å øke vev transparens 8. I de siste årene er en rekke vev clearing metoder utviklet, noe som reduserer vev opasitet og lysspredning, som BABB (benzylalkohol og benzyl benzoate blanding) og DBE (tetrahydrofuran og dibenzylether); men i disse metodene, fluorescensslukking forblir et problem 8-10. Den løsemiddelbasert hydrofile metoder, for eksempel SeeDB (fruktose / thioglycerol) og 3DISCO (diklormetan / dibenzylether), bevare fluorescerende signaler, men ikke gjengi hele orgelet gjennomsiktig 7,8,11. Til sammenligning gjengir CLARITY vev-clearing metode orgelet gjennomsiktig, men det krever en spesialisert elektroforese enhet for å fjerne lipider 8,12, som gjør PACT (passiv klarhet teknikk), som også krever hydrogel innebygging 7,13. For detaljert informasjon om alle tilgjengelige vev-clearing metoder, se tabell 1 i Richardson og Lichtman, et al. 7.
I 2011 Hama et al. Serendipitously oppdaget en hydrofil blanding 'Sca le' (urea, glyserol og Triton X-100 blanding) som gjør musen hjernen og embryo gjennoent mens fullstendig bevare fluorescerende signaler fra merket kloner 14. Dette gjør det mulig for avbildning av den intakte hjerne i en dybde på flere millimeter og store rekonstruksjon av neuronale populasjoner og fremspring på en subcellulære oppløsning. Susaki et al. ytterligere forbedret Sca le ved å legge aminoalkoholer og utviklet 'cubic' (klar, uhindret hjernen imaging cocktailer og beregningsorientert analyse) vev clearing metoden, som økte fosfolipid oppløselighet, redusert clearing tid, og er tillatt for flerfarget fluorescerende bildebehandling 8. I denne studien var å dra nytte av Sca le og CUBIC vev clearing teknikker og høyoppløselig 3D optisk snitting individuelle kloner inne i hjertet under cardiogenesis spores ved hjelp Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> Nfatc1-Cre 19, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer. Kombinasjonen av hele mount farging (WMS) metode som er utviklet tidligere 21,22 med vev tømme metoder ytterligere tillatt for farging av andre proteiner i merkede kloner og for studier av deres oppførsel i et 3D volumetrisk kontekst. Kombinasjonen av vev clearing og WMS åpner for en bedre forståelse av rollene til forskjellige gener og proteiner i løpet av hjertestans utvikling, og etiologien av medfødte hjertefeil. Denne protokollen kan brukes til å studere andre stamcelledifferensiering, celle oppførsel, og organ morfogenese begivenheter i utviklingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embryoet isolasjon er et meget kritisk trinn. E9.5 embryoer er svært skjør og liten i størrelse, så ekstra forsiktighet bør utvises for ikke å skade fosteret / hjerte strukturer under isolasjon. De ikke-embryonale ekstra lag omslutter fosteret / hjerte bør fjernes forsiktig, spesielt når avbildning hele embryo. Dette gjør at antistoff og clearing blanding penetrasjon dypt inne i embryonale vev, og hjelper også på å fjerne bakgrunnssignalet når bildebehandling. Flere antistoffer inkludert antistoffer mot PEC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
