SNARE-mediert Fusion Single Proteoliposomes med tethered Støttede bilagene i en mikrofluid Flow Cell overvåkes av polarisert TIRF Mikroskopi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å detektere enkelt, skarptromme-mediert fusjonshendelser mellom liposomer og støttet bilagene i microfluidic kanaler ved hjelp av polarisert TIRFM, med enkelt molekyl følsomhet og ~ 15 ms tidsoppløsning. Lipid og løselig last utgivelsen kan oppdages samtidig. Liposomstørrelseforandringer, lipid diffusivitet, og fusion pore egenskaper måles.

Abstract

I allestedsnærværende fremgangsmembranfusjon åpningen av et fusjons pore etablerer den første forbindelse mellom to tidligere adskilte rom. Under neurotransmitter eller hormon utgivelse via eksocytose, kan fusjon pore forbigående åpne og lukke gjentatte ganger, som regulerer lastefrigjøringskinetikk. Pore ​​dynamikk også bestemme modus for vesikkel resirkulering; irreversible forseglingsegenskaper resultater i forbigående, "kiss-and-run" fusion, fører mens utvidelse til full fusjon. For bedre å forstå hvilke faktorer som styrer pore dynamikk, har vi utviklet en analyse for å overvåke membran fusjon ved hjelp av polarisert total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi med enkelt molekyl følsomhet og ~ 15 ms tidsoppløsning i en biokjemisk veldefinert in vitro system. Fusjon av fluorescensmerkede små unilamellære vesikler som inneholder v-SNARE-proteiner (v-SUV) med en plan bilags peiling t-snarer, støttet på en myk polymer pute (t-SBL, t-støttet bilags), Blir overvåket. Analysen bruker microfluidic strømningskanaler som sikrer minimal prøve forbruket samtidig leverer en konstant tetthet av SUVer. Utnyttelse den raske signalforsterkning ved overføring av lipid etiketter fra SUV til SBL under fusjon, er kinetikk av lipid dye transfer overvåkes. Sensitiviteten av TIRF mikros tillater relativ enkle lipid fluorescerende merkelapper, fra hvilken lipid diffusivitet og SUV størrelse kan utledes for hver fusjon arrangement. Lipid fargestoff utgivelsen tider kan være mye lengre tid enn forventet for uhindret passasje gjennom permanent åpne porene. Ved hjelp av en modell som foruts retardasjon av lipid utgivelsen skyldes pore flimring, en pore "åpenhet", brøkdel av tiden pore forblir åpen under fusjon, kan estimeres. Et løselig markør kan være innkapslet i SUVer for samtidig overvåkning av lipid og løselig last utgivelse. Slike målinger angir noen porer kan forsegles på nytt etter å ha mistet en del av det løselige last.

Introduction

Membran fusion er en universell biologisk prosess som kreves for intracellulær trafficking av lipider og proteiner, sekresjon, gjødsling, utvikling, og innhyllet virus oppføring i vertsorganismer ^1-3. For de fleste intracellulær fusjon reaksjoner inkludert frigjøring av hormoner og signalstoffer via eksocytose, er energi å fusjonere to lipidbilagene levert av dannelsen av en fire-heliksbunt mellom beslektet løselig N-etylmaleimid sensitiv faktor vedlegg protein reseptor (Snare) proteiner, forankret i vesikkel (v-SNARE) og målet membran (t-SNARE) ^4, henholdsvis. Synaptic vesicle eksocytose er den mest strengt regulert fusjonsreaksjon og skjer innen et millisekund etter ankomst av et aksjonspotensial ^1,4,5. Sammensmeltingen pore, den første forbindelse mellom de to fusing avdelinger, kan flimre åpen og lukket flere ganger før forsegles eller utvide irreversibelt ^5-7. Den tidligere resultaterforbigående, "kiss & run" fusion, mens sistnevnte fører til full fusjon. Faktorer som regulerer balansen mellom disse to modusene for fusjon og mekanismer som regulerer pore flimring er ikke godt forstått ^5,8.

Snare proteiner er nødvendig for eksocytose; synaptisk vesikkelfusjon er avskaffet ved spalting av snarer av nervegifter ^9. Bulk fusion eksperimenter med små unilamellære vesikler (SUV) viste at snarer er ikke bare nødvendig, men også tilstrekkelig til å drive membranfusjon ^10. I denne analysen bulk, SUV rekonstituert med v-snarer (v-SUV) ble dopet med fluorescerende fosfolipider (N – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) og ( N -. (lissamin rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) og blandet med umerkede vesikler som inneholder t-snarer (t-SUV) Opprinnelige fluorescens av NBD-PE i v-SUV ble stanset ved Förster resonans energi overføring (FRET ) til LR-PE. Som labeLED v-SUVer fusjonere med umerkede t-SUVer, blir fluoroforen overflatetetthet i nå kombinert membran redusert og den resulterende økningen i NBD-PE fluorescens rapporterer omfanget av lipid blande ^10. Ettersom hoveddelen analysen er lett å sette opp og analysere, har det vært mye brukt for å studere mekanismene for SNARE-mediert fusjon ^10-14. Det har imidlertid flere begrensninger, slik som lav følsomhet og dårlig tidsoppløsning. Viktigst, som et ensemble måling, det gjennomsnitt resultater over alle hendelser som gjør diskriminering mellom dokking og fusjon, samt deteksjon av hemifusion mellomprodukter vanskelige.

Det siste tiåret har flere grupper, inkludert våre, har utviklet nye metoder for å overvåke fusion hendelser på singelen vesikkel nivå ^15-27. Ha og kolleger brukte v-SUVer tjoret på en overflate og overvåket sin fusjon med gratis t-SUVer ^18,19. Lipidblanding ble overvåket ved bruk av FRET mellom et par av lipid-bundne fluoroforer emsengs i v- og t-SUVer, henholdsvis ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikros ^18. Senere Brunger laboratorium brukes en enkelt lipid-label arter sammen med et innhold markør for samtidig påvisning av lipid og innhold blande ^20,28. Både lipid og innholdet markører ble inkludert ved høye, selvlukkende konsentrasjoner; fusjon med umerkede SUVer resulterte i fluorescens dequenching ^20,28.

Andre har smeltet v-SUV til planar bilayers rekonstituert med t-snarer ^{15-17,21-27,29.} Den plane geometri målet (t-SNARE holdige) dobbeltlag bedre etterligner den fysiologiske fusjon prosessen av små, svært buede vesikler med flatskjerm plasma membran. Den Steinem gruppe næringsdrivende pore spennende membraner rekonstituert med t-snarer, suspendert over et porøst silisiumnitrid substrat og oppdaget fusjon med individuelle v-SUVer bruker konfokal laser scanning mikros ^23. andre fbrukte v-SUV til planar bilayers rekonstituert med t-snarer, støttet på et glass substrat ^{15-17,21,22,24-27,29.} Den store fordelen med å bruke støttede dobbeltlag (SBLs) er at TIRF mikroskopi kan brukes til å oppdage tilkoblings og fusjonsbegivenheter med utmerket signal-til-støy-forhold og uten innblanding fra frie v-SUVer, selv om du bruker MicroFluidics gir også enkelthendelse oppløsning ved hjelp av standard langt-feltet epifluorescence mikros ^24.

En stor bekymring er hvorvidt og hvordan substrat-bilaget interaksjoner påvirke støttet bilagskvalitet og fusjonsprosessen. Tidlig arbeid gjort bruk av planar SBLs som var direkte understøttet på et glass eller kvarts substrat ^15-17. Disse SBLs ble laget ved adsorpsjon, sprengning, spredning og blanding av t-SUV-membraner på substratet. Det ble snart innså imidlertid at å utelate en nøkkel t-SNARE komponent, SNAP25, fra SBLs fremstilt på denne måten resultert i v-SUV docking og fusion kinetikk indistinguisHable fra de som oppnås ved bruk av komplett t-snarer ^17. Fordi SNAP25 er absolutt nødvendig for fusjon in vivo ^30,31, ble den fysiologiske betydningen av disse tidlige forsøk satt i spørsmålet. Tamm gruppe vant denne utfordringen ved å bruke bedre kontrollert støttet bilagsdannelse ^21. Det pleide Langmuir-Blodgett avsetning for proteinfritt første vedlegget SBL, etterfulgt av fusjon av at enkeltlag med t-SUVer ^21. Dette resulterte i SNAP25 avhengig fusjon.

For å unngå eventuelle gjenstander i forbindelse med en to-lags direkte understøttet på et glass-substrat uten behov for å bruke Langmuir-Blodgett metoder, Karatekin et al., Innføres en myk, hydratisert poly (etylenglykol) (PEG) pute mellom bilaget og substratet ^24. Denne endringen resulterte også i SNAP25 avhengig fusjon ^24. Bilag polstrede på en myk polymersjikt hadde vært kjent for å bedre bevare transmembraneprotein mobilitet og funksjon ^32, og hadde blitt brukt i fusjonsstudier med virus ^33. I tillegg pegylert bilag synes å beholde noen evne til selv helbrede og er veldig robust ^34,35. Først blir en fraksjon av kommersielt tilgjengelige, lipid-koblet PEG-kjedene som inngår i t-SUV membran. Når disse t-SUVer sprekke og danne en plan dobbeltlag på et glass substrat, en PEG børste dekker både flygeblader av den plane bilaget. Fordi plane bilagsdannelse er drevet av adhesjon av PEG-kjedene omkring t-SUVer på den hydrofile glassoverflaten, liposom sprengning og plane bilagsdannelse er forholdsvis ufølsomme overfor lipid preparat som brukes. Imidlertid, når store mengder av kolesterol er inkludert, øker de kohesive egenskaper av SUV, SUV kan ikke briste spontant. Dersom dette er tilfelle, kan osmotisk sjokk eller toverdige ioner anvendes for å hjelpe plane bilagsdannelse ^25.

Som nevnt ovenfor, i dette apming en PEG børste dekker begge sider av den plane, støttet bilaget. Børsten som vender mot mikrofluidstrømningskanalen bidrar til å hindre ikke-spesifikk adhesjon av innkommende v-SUVer som også vanligvis er dekket med et lag PEG. Dannelse av V- og T-snare komplekser starter fra membranen-distal N-termini og fortsetter i etapper mot membran-proksimale domener ^36. Til V-SUVer å interagere med T-SBL, V- og T-SNARE N-termini behovet for å stikke opp over PEG børster, som synes å være tilfelle under betingelsene for analysen. Børste høyde kan tilpasses til å studere andre enn feller proteiner ved å variere tettheten av PEGylerte lipider og PEG kjedelengde ^37,38. En annen fordel med PEG børster dekker proksimale overflater av fikserings bilagene er at de etterligner den overfylt miljø av biologiske membraner som er fullpakket med 30,000-40,000 integrerte membranproteiner per kvadrat micron ^39. Akkurat som PEG-kjedene i denne analyse ble repulsive proteinlaget som dekker biologiske membraner trenger å bli skjøvet til side for å tillate kontakt mellom de to fosfolipid dobbeltlag for fusjon til å forekomme.

Mikrofluidstrømningskanaler er brukt i denne analysen, siden de tilbyr unike fordeler. Først gjør microfluidic flyt mer enhetlig deponering av T-SUV til å spre og sikring for å danne t-SBL. For det andre, den lille kanal volum (<1 ul) minimaliserer prøve forbruk. For det tredje, de små volumer som kreves for at hele eksperimentet som skal utføres under konstant strømning. Flow fjerner svakt, antagelig ikke-spesifikt, følges v-SUV fra SBL ^16. Det opprettholder også en konstant tetthet av v-SUVer over t-SBL, forenkle kinetisk analyse ^17. Endelig er forankret vesikler lett skilles fra gratis de båret av flyten ^25. Fjerde, flere microfluidic kanaler kan brukes på samme dekkglass, hver sondering en annen tilstand. Dette gjør det mulig å sammenligne forholdene During den samme forsøkskjøring. En lignende tilnærming har blitt brukt av van Oijen gruppe for å studere fusjon mellom influensavirus og polstrede SBLs ^33.

I TIRF mikroskopi, den eksponentielle desintegrasjon av det svinnende felt (med en desintegrasjonskonstanten ~ 100 nm) rammen fluorescenseksitasjon i de molekyler som er i umiddelbar nærhet av glass-buffer grensesnitt. Dette reduserer bidraget av fluorescerende molekyler som er lenger bort, øker signal-til-støyforholdet, og gjør det mulig enkelt molekyl følsomhet med ramme eksponeringstider på 10-40 msek. Den flyktige feltet fører også til et signal økning på fusjon: som den merkede lipider overføring fra SUV inn i SBL, befinner de seg i gjennomsnitt i en sterkere eksitasjon felt. Økningen i fluorescens er sterkere for større liposomer.

Når polarisert lys blir brukt til å generere det flyktige feltet, ytterligere effekter bidrar til endringene i fluorescens ved transfer av etiketter fra SUV inn i SBL. Noen fargestoffer lipid har en overgang dipol orientert med en foretrukket midlere vinkel med hensyn til dobbeltlaget, hvor de er innleiret. Dette skaper en forskjell i mengden av fluorescens emittert ved fluoroforene når de er i SUV versus SBL, ettersom det polariserte strålen vil eksitere fargestoffer i de to membraner på en annen måte. For det første, vil eksiteringen bjelken samhandle med overgangs dipoler orientert rundt den sfæriske SUV, mens det for den sistnevnte, vil dipol-orienteringer være begrenset av den flate SBL geometri. For eksempel, når s-polarisert innfallende lys (polarisert vinkelrett på innfallsplanet) anvendes, er eksitasjon mer effektiv når fargestoffet er i den SBL enn i SUV for et lipid fargestoff overgang dipol orientert parallelt med membranen ^29,40 (slik som for Dil eller gjorde ^41-43). En SUV dopet med en slik fluorofor vises dimme når det dokker ut mot SBL (figur 7, Representat ive resultater). Som en fusjon pore åpner og forbinder SUV og SBL membraner, fluorescerende prober diffus i SBL og bli mer sannsynlig å bli begeistret av s-polarisert flyktig felt ^25,27,29. Følgelig fluorescens signal integreres over hele fusjons området øker sterkt i løpet av farvestoffoverføring fra SUV inn i SBL ²⁷ (figur 3 og figur 7). En ytterligere faktor som bidrar til å signalisere endringene som følger fusjon blir dequenching av fluorescerende markører som de fortynnes når de overføres inn i SBL. Bidraget av dequenching er vanligvis liten i forhold til evanescent felt råte og polariseringseffekter i analysen beskrevet her, fordi bare en liten del ( ) Av lipidene er merket.

Signalet Økningen ved fusjon kan utnyttes til å utlede fusjon poreegenskapene ved å sammenligne den tid,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, som kreves for en lipid å flykte gjennom en pore som er fritt gjennomtrengelig for lipider til selve utgivelsen tid, . Dersom de to tidsskalaer er sammenlignbare, vil det bli konkludert med at den pore presenterer liten motstand mot strømning lipid. Men hvis selve utgivelsen tid er betydelig lengre enn tiden for diffusjon begrenset utgivelse, ville dette indikere en prosess, for eksempel pore flimring, hemmende lipid utgivelse. Spredningen begrenset utgivelsen tid, , Avhenger av størrelsen av fikserings liposom og lipid-diffusivitet; sin estimering krever disse to parametere som skal kvantifiseres. Den eneste molekyl sensitiviteten til analysen tillater lipid diffusivitet som skal måles ved å spore flere enkelt lipid fluoroforer etter at de slipper inn i SBL for hver fusjon arrangement ^26. Størrelsen av hver fikserings vesikkelkan estimeres ²⁷ ved å kombinere (i) intensiteten av et enkelt lipid fargestoff, (ii) endringen i total fluorescens rundt et forankrings område etter at alle fluoroforen blir overført til SBL ved fusjon, (iii) den kjente merking tettheten av SUV lipider, og (iv) det areal per lipid. For mange fusjonsbegivenheter, ble selve lipid frigjørings ganger funnet å være mye tregere enn forventet ved diffusjon-kontrollert frigjøring ^27, som ble nevnt tidligere forutsatt uniform SUV størrelse ^44. Forutsatt retardasjon av lipid utgivelsen skyldes pore flimring, tillater en kvantitativ modell estimering av "pore åpenhet", brøkdel av tiden pore forblir åpen i fusion ^27.

Når praktisk, er det viktig å teste fusjons mekanismer ved hjelp av både lipid og oppløselige innhold etiketter. For eksempel kan lipid utgivelsen være tilbakestående av andre enn pore flimrende prosesser, for eksempel begrensning av lipid diffusjon av snaren proteiner som surround than pore. Hvis dette var tilfelle, og slipp av innholdet vil gå forut for utgivelsen av lipid etiketter, forutsatt at pore er stor nok til å tillate passasje av løselige sonder. En mer grunnleggende feil i tilnærmingen kan være i antakelsen om at overføringen av merket lipider til SBL skjer gjennom en smal fusjon pore kobler SBL til en vesikkel som i stor grad har beholdt sin pre-fusion form. Lipid overføringen til SBL kan også skyldes hurtig utvidelse av fusjons pore med en samtidig, ekstremt hurtig sammenbrudd av SUV inn i SBL membranen, som tidligere er foreslått basert på lipid frigjøringsdata alene ^29. Overvåking av både lipid og innholdet slipper samtidig, ble det funnet at mange porer lukkes igjen etter frigjøring alle deres lipid-etiketter, men beholdt noen av deres oppløselige last ^27. Dette indikerer at i det minste noen av liposomer ikke kollapser inn i SBL etter fusjon, og at lipidet farvestoffoverføring inn i SBL skjer gjennom en fusjon pore. I tillegg er lipid og innholdet utgivelsen skjedde samtidig ^27, noe som gjør det usannsynlig at retardasjon av lipid utgivelsen skyldes hindring av lipid diffusjon av snaren proteiner rundt pore ^45.

En SUV-SBL fusjon protokoll som ikke overvåke løselige innholdet meldingen ble tidligere utgitt av Karatekin og Rothman ^25. Her er mer den siste utviklingen med, nemlig samtidig overvåking av lipid og innholdet slipp og estimering av SUV, lipid, og fusion pore egenskaper ^27. Protokollen starter med instruksjoner for utarbeidelse av microfluidic celler, laget ved å binde en poly (dimetylsiloksan) (PDMS) elastomer blokk inneholder riller med et glass dekk ^25. Deretter er utarbeidelse av v-SUVer med både lipid og innhold markører forklart. § 4 og § 5 gi instruksjoner for montering av microfluidic celler, danner de SBLs in situ og se etter feil og flyt, innføring av VSUVS i strømnings celler og påvisning av fusjonsbegivenheter. § 6 gir instruksjoner for dataanalyse.

Protocol

1. Utarbeidelse av en PDMS Block å danne mikrofluid Channel Figur 1. microfabrication av strømningscelle templat og PDMS blokk forberedelse. (A) Design av en fire-kanals strømningscelle som passer på en 24 x 60 mm glass dekkglass (nederst). Seks identiske design er arrangert for å passe inn i en 10 cm silisium wafer (øverst). (B) Kutt ut blokk på ca …

Representative Results

SBL Kvalitet Det er viktig å kontrollere kvaliteten og flyt av SBL før fusjonen forsøket. Fluorescensen ved bunnen, glass side av en mikrofluidteknisk kanal bør være ensartet, uten noen åpenbare defekter. Hvis en luftboble passerer om kanalen, vanligvis forlater det synlige arr på SBL. Hvis det er slike store arr / feil, ikke bruk denne kanalen. Noen ganger SUVer kan forholde seg til underlaget, men ikk…

Discussion

Vellykket gjennomføring av SUV-SBL fusjon analysen beskrevet her, avhenger kritisk av flere viktige skritt, for eksempel funksjonell tilberedning av proteiner i liposomer, få god kvalitet SBLs, og velge de riktige bildeparameterne for å oppdage enkle molekyler. Selv om det kan ta litt tid og krefter på å lykkes, når analysen er gjennomført med suksess, gir det et vell av informasjon om fusjonsprosessen ikke er tilgjengelig fra noen annen in vitro fusjon analysen diskutert i Introduksjon. Satsene ved hvil…

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water	Millipore
KOH	J.T. Baker	3040-05
Ethanol 190 Proof	Decon
Isopropanol	Fisher Chemical	A416P4
HEPES	AmericanBio	AB00892
Sodium Cholride (KCl)		AB01915
Dithiothreitol		AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	AmericanBio	AB00892
EGTA	Acros Organics	409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)			25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform	J.T. Baker	9180-01	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol	J.T. Baker	9070-03	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe	Hamilton	var. sizes	only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)	http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube	Pyrex	70825-16	clean thoroughly, rinse with chloroform	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457	Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening	http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)		840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)		850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2		840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE		810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE		880130
cholesterol (ovine wool, >98%)		700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)	Molecular Probes	D-307		https://www.thermofisher.com/
Rotavapor R-210	Buchi	R-210	heat bath above Tm of lipids used	http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside	Affymetrix	0311	store at -20°C, let come to RT before opening	https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R	Eppendorf			https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL	life technologies	66003		https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	1523920		http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556		http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	41121703		https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB	Molecular Probes	S-1307		https://www.thermofisher.com/
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	7372512		http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B	GE Healthcare	17-0150-01		http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain	Molecular Probes	S-6650	5,000X Concentrate in DMSO	https://www.lifetechnologies.com/
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS	Dow Corning	3097358-1004		http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover	Corning	3160-152		http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm	World Precision Instruments	504529		http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine	SYNEO	MHPM-UNV		http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch		CR0350265N20R4	drill diameter: 0.9 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD	Cole-Parmer	06419-00	0.010" ID, 0.030" OD	http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD		95802-00	0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass -  cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D	Schott	1472305		http://www.us.schott.com/
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G		http://harrickplasma.com/
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body	Olympus	IX81		http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera	Andor	ixon-ultra-897		http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage	Tokai Hit	MATS-U52RA26		http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x)	Hamilton	81365		http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump	kd Scientific	KDS-230		http://www.kdscientific.com/