SNARE-medierad fusion av Single proteoliposomer med tjudrad bilayers stöds i en mikroflödes Flow Cell övervakas av polariserat TIRF mikroskopi

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att detektera enstaka, snara-medierad fusion händelser mellan liposomer och stöds dubbelskikt i mikroflödessystem kanaler med hjälp av polariserat TIRFM, med enda molekyl känslighet och ~ 15 ms tidsupplösning. Lipid och löslig lastfrigör kan detekteras samtidigt. Liposomstorlek, lipid diffusivitet, och fusion pore egenskaper mäts.

Abstract

I den allestädes närvarande processen för membranfusion öppnandet av en fusion por etablerar den första anslutningen mellan två tidigare separata fack. Under signalsubstans eller hormonfrisättning via exocytos, fusions por kan övergående öppna och stänga flera gånger, som reglerar lastfrisättningskinetik. Pore ​​dynamik bestämmer också läget av vesikler återvinning, irreversibla återförslutning resulterar i övergående, "kiss-and-run" fusion leder medan utvidgning till full fusion. För att bättre förstå vilka faktorer styr pore dynamik, utvecklade vi en analys för att övervaka membranfusion med hjälp av polariserat total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi med enda molekyl känslighet och ~ 15 ms tidsupplösning i ett biokemiskt väldefinierat in vitro-system. Fusion av fluorescerande små unilamellära vesiklar som innehåller v-SNARE proteiner (v-SUV) med en plan tvåskiktsmembran bärande t-snaror, uppburen på en mjuk polymer kudde (t-SBL, t-stöd tvåskiktsmembran), Övervakas. Analysen använder mikroflödessystem flödeskanaler som säkerställer minimal provförbrukningen samtidigt leverera en konstant densitet av stadsjeepar. Utnyttja den snabba signalförstärkning vid överföring av lipid etiketter från SUV till SBL under fusion, är kinetiken lipid färgöverförings övervakas. Känsligheten hos TIRF mikroskopi tillåter att spåra enskilda fluorescerande lipid etiketter, från vilken lipid diffusivitet och SUV storlek kan härledas för varje fusion händelse. Lipid färgfrisättningstider kan vara mycket längre än väntat för obehindrad passage genom permanent öppna porer. Med hjälp av en modell som förutsätter fördröjning av lipid frisättning beror på pore flimmer, en por "öppenhet", den del av tiden porerna förblir öppen under fusion, kan uppskattas. En löslig markör kan inkapslas i SUV för samtidig övervakning av lipid och löslig last release. Sådana mätningar indikerar vissa porer kan återförsluta efter att ha förlorat en del av den lösliga last.

Introduction

Membranfusion är en universell biologisk process som krävs för intracellulär handel med lipider och proteiner, utsöndring, gödsling, utveckling och insvept virus inträde i värdorganismer ^1-3. För de flesta intracellulära fusionsreaktioner inklusive frisättning av hormoner och signalsubstanser via exocytos, är energin för att sammansmälta två lipiddubbelskikt tillhandahålls genom bildning av ett fyra-helix bundle mellan cognate löslig N-etylmaleimid-känslig faktor fastsättning proteinreceptor (SNARE) proteiner, förankrad i vesikeln (v-SNARE) och målmembranet (t-SNARE) ^4, respektive. Synaptic vesikler exocytos är den mest hårt reglerad fusion reaktion och inträffar inom en millisekund efter ankomsten av en aktionspotential ^1,4,5. Fusions por, den första anslutningen mellan de två fixerings facken, kan flimmer öppna och slutna flera gånger innan återförslutning eller expandera irreversibelt ^5-7. De tidigare resultatövergående, "Kiss & run" fusion, medan den senare leder till full fusion. Faktorer som styr balansen mellan dessa två typer av fusion och mekanismer som reglerar por flimmer är inte väl förstått ^5,8.

SNARE proteiner krävs för exocytos; synaptiska vesikelfusion avskaffas vid klyvning av snaror av neurotoxiner ^9. Bulkfusionsexperiment med användning av små unilamellära vesiklar (SUVs) visade att snaror inte bara krävs, men också tillräcklig för att driva membranfusion ^10. I detta bulk assay, SUVs rekonstitueras med v-snaror (v-SUV) till dopad med fluorescerande fosfolipider (N – (7-nitro-2-1,3-bensoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) och ( N -. (lissaminrodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) och blandades med omärkta vesiklar innehållande t-snaror (t-SUV) Initialt fluorescensen av NBD-PE i v-SUVs släckes genom Förster resonansenergiöverföring (FRET ) till LR-PE. som labELED v-SUV smälta samman med omärkta t-SUV, är fluoroforen ytdensitet i det nu kombinerade membranet reduceras och den resulterande ökningen i NBF-PE fluorescens rapporterar omfattningen av lipidblandning ^10. Som bulk analysen är lätt att ställa upp och analysera, har det i stor utsträckning använts för att studera mekanismerna för SNARE-medierad sammansmältning ^10-14. Det har dock flera begränsningar, såsom låg känslighet och dålig tidsupplösning. Viktigast som en ensemble mätning, det genomsnitt resultat under alla omständigheter gör diskriminering mellan dockning och fusion, samt detektering av hemifusion mellan svårt.

Under det senaste årtiondet flera grupper, inklusive vårt, har utvecklat nya analyser för att övervaka fusions evenemang på enstaka vesikler nivå ^15-27. Ha och kollegor använde v-SUV bundna på en yta och övervakas deras fusion med gratis t-SUV ^18,19. Lipidblandning övervakades med användning av FRET mellan ett par lipid-bundna fluoroforer embäddas in i v- och t-SUV, respektive, med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi ^18. Senare Brunger laboratorium använde en enda lipid-label art tillsammans med en innehåll markör för samtidig detektion av lipid och innehåll blanda ^20,28. Både lipid och innehållet markörerna ingick vid höga, självläckande koncentrationer; fusion med omärkta SUVs resulterade i fluorescens dequenching ^20,28.

Andra har smält v-SUV till plana bilayers ombildade med t-snaror ^{15-17,21-27,29.} Den plana geometri målet (t-SNARE innehållande) biskikt bättre efterliknar den fysiologiska fusionsprocessen av små, mycket böjda vesiklar med platt plasmamembranet. Den Steinem grupp som användes pore överbryggande membran rekonstituerade med t-snaror, suspenderade genom ett poröst kiselnitrid substratet och detekteras fusion med enskilda v-SUVs med användning av konfokal laserscanningsmikroskopi ^23. andra fbegagnade v-SUVs till plana biskikt rekonstituerade med t-snaror, uppburen på ett glassubstrat ^{15-17,21,22,24-27,29.} Den stora fördelen med att använda stöds dubbla skikt (SBLs) är att TIRF mikroskopi kan användas för att detektera dockning och fusion händelser med utmärkt signal-brusförhållande och utan inblandning från fria v-SUV, även om användning av mikrofluidik ger också enstaka händelse upplösning med standard fjärrfälts epifluorescensmikroskopi ^24.

En viktig fråga är om och hur substrat tvåskiktsmembran interaktioner påverkar stöds tvåskiktsmembran kvalitet och fusionsprocessen. Tidigt arbete utnyttjade plana SBLs som direkt stöd på ett glas eller kvartssubstrat ^15-17. Dessa SBLs gjordes genom adsorption, spricker, spridning och blandning av t-SUV membran på substratet. Det var snart insåg dock att utelämna en viktig t-SNARE komponent, SNAP25 från SBLs framställda på detta sätt resulterade i v-SUV dockning och fusion kinetik indistinguisHable från de som erhållits genom att använda den fullständiga t-snaror ^17. Eftersom SNAP25 är absolut nödvändig för fusion in vivo ^30,31, var den fysiologiska relevansen av dessa tidiga försök ifrågasättas. Tamm grupp klarade denna utmaning genom att använda kontrolleras bättre stöd tvåskiktsmembran bildning ^21. Det brukade Langmuir-Blodgett avsättning för proteinfritt första broschyr av SBL, följt av fusion av det monolager med t-SUV ^21. Detta resulterade i SNAP25 beroende fusion.

För att undvika potentiella artefakter associerade med ett dubbelskikt direkt uppburen på ett glassubstrat utan behov av att använda Langmuir-Blodgett metoder, Karatekin et al. Infört en mjuk, hydratiserad poly (etylenglykol) (PEG) kudde mellan dubbelskiktet och substratet ^24. Denna modifiering resulterade också i SNAP25 beroende fusion ^24. Dubbelskikt vadderade på ett mjukt polymerskikt hade varit kända för att bättre bevara transprotein rörlighet och funktion ^32, och hade använts i fusionsstudier med virus ^33. Dessutom PEGylerade bilayers tycks behålla en del förmåga att självläka och är mycket robust ^34,35. Först är en fraktion av kommersiellt tillgängliga, lipid-länkad PEG-kedjor som ingår i t-SUV membran. När dessa t-SUVs brista och bilda en plan tvåskiktsmembran på ett glassubstrat, omfattar en PEG borste båda broschyrer av den plana biskikt. Eftersom plana biskikt bildning drivs av vidhäftning av PEG-kedjor närliggande t-SUVs på den hydrofila glasytan, liposom sprängning och plana biskikt bildning är relativt okänsliga för lipidkompositionen användas. När emellertid stora mängder kolesterol ingår, ökar de kohesiva egenskaperna hos SUVs, SUVs kanske inte brista spontant. Om detta är fallet, kan osmotisk chock eller tvåvärda joner användas för att hjälpa till plana biskikt bildning ^25.

Såsom nämnts ovan, i detta apgrepp en PEG borste täcker båda sidorna av den plana, uppburen dubbelskiktet. Borsten mot mikroflödesflödeskanalen hjälper till att förhindra ospecifik vidhäftning av inkommande v-SUV som också är oftast täckt med en PEG lager. Bildning av V- och t-SNARE-komplex utgår från membran distala N-terminaler och fortsätter i etapper mot membran-proximala domänerna ^36. För v-SUV att interagera med t-SBL, V- och t-SNARE N-terminaler är nödvändigt att skjuta över PEG borstar, som verkar vara fallet i enlighet med villkoren i analysen. Borsthöjden kan anpassas för att studera andra än snaror proteiner genom att variera densiteten hos PEGylerade lipider och PEG kedjelängd ^37,38. En annan fördel med de PEG-borstar som täcker de proximala ytorna av fixerings bilayers är att de efterliknar det trånga miljön i biologiska membran, vilka är packade med 30,000-40,000 integrerade membranproteiner per kvadratmikron ^39. Precis som de PEG-kedjor i denna analys, den Repulsive proteinskikt som täcker biologiska membran måste skjutas åt sidan för att tillåta kontakt mellan de två fosfolipid bilayers för fusion skall ske.

Mikroflödesströmningskanaler används i denna analys, eftersom de erbjuder unika fördelar. Först gör mikroflödes flöde jämnare avsättning av T-SUV för att sprida och säkring för att bilda t-SBL. För det andra, (<1 l) minimerar den lilla kanalvolymen provförbrukning. För det tredje, de små volymer som behövs låta hela experimentet genomföras under konstant flöde. Flow avlägsnar svagt, förmodligen ospecifikt, vidhäftade v-SUV från SBL ^16. Det har även en konstant densitet av v-SUV ovanför t-SBL, förenklar kinetisk analys ^17. Slutligen dockade blåsor lätt skiljas från fri dem som bärs av flödet ^25. Fjärde flera mikroflödessystem kanaler kan användas på samma täck varje sondering olika tillstånd. Detta möjliggör jämförelser av villkor During samma experimentkörning. Ett liknande tillvägagångssätt har använts av van Oijen för att studera fusion mellan influensavirus och vadde SBLs ^33.

I TIRF mikroskopi, den exponentiella avklingningen av det evanescenta fältet (med en sönderfallskonstant ~ 100 nm) begränsar fluorescensexcitation till de molekyler som är i mycket nära anslutning för det glasbuffertgränssnittet. Detta minimerar bidraget från fluorescerande molekyler som ligger längre bort, ökar signal-brusförhållande, och tillåter enda molekyl känslighet med ram exponeringstider på 10 till 40 msek. Det evanescenta fältet leder också till en signalökning på fusion: som den märkta lipider överföring från SUV till SBL, de befinner sig, i genomsnitt, en starkare exciteringsfältet. Denna ökning i fluorescens är starkare för större liposomer.

Om polariserat ljus används för att generera det evanescenta fältet, ytterligare effekter bidra till förändringar i fluorescens vid tverför av etiketter från SUV i SBL. Vissa lipid-färgämnen har en övergångs dipol orienterad med en föredragen medel vinkel med avseende på dubbelskiktet i vilket de är inbäddade. Detta skapar en skillnad i mängden av fluorescens som emitteras av de fluoroforer när de är i SUV kontra SBL, eftersom den polariserade strålen att excitera färgämnen i de två membranen på olika sätt. För de förstnämnda kommer excitationsstrålen interagera med övergångs dipoler orienterade kring den sfäriska SUV, medan det senare kommer dipol riktlinjer begränsas av den plana SBL geometri. Till exempel, när s-polariserade infallande ljuset (polariserat vinkelrätt mot infallsplanet) används, är excitering mer effektiv när färgämnet är i SBL än i SUV för en lipid färgämne övergångs dipol orienterad parallellt med membranet ^29,40 (såsom den av Dil eller gjorde ^41-43). En SUV dopad med en sådan fluorofor visas dim när den dockar har laddats in i SBL (Figur 7, Representat ive Resultat). Som en fusion pore öppnas och förbinder de SUV och SBL membran, fluorescerande prober diffundera in i SBL och blir mer sannolikt att exciteras av s-polariserade evanescent fält ^25,27,29. Följaktligen ökar fluorescenssignalen integreras runt fusionsstället kraftigt under färgöverföring från SUV till SBL ²⁷ (Figur 3 och Figur 7). En ytterligare faktor som bidrar till signal förändringar som följer fusion dequenching av fluorescerande markörer som de späds när de överförs in i SBL. Bidraget från dequenching är vanligtvis små i jämförelse med evanescent fältröta och polariseringseffekter i analysen beskriven här, eftersom endast en liten fraktion ( ) Av lipiderna är märkta.

Signalökning vid fusion kan utnyttjas för att härleda fusion pore egenskaper genom att jämföra den tid,1 "src =" / filer / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, som krävs för en lipid fly genom en por som är fritt permeabel för lipider till frigöra tid själva, . Om de två tidsskalor är jämförbara, skulle man dra slutsatsen att porerna uppvisar litet motstånd mot lipid flödet. Men om frigöra tid själva är betydligt längre än den tid för diffusion begränsad frisättning, skulle detta tyda på en process, såsom porer flimmer, fördröjer lipid release. Spridning begränsade frigöra tid, , Beror på storleken av fixerings liposomer och lipid-diffusivitet; sin uppskattning kräver dessa två parametrar som skall kvantifieras. Den enda molekyl känsligheten för analysen tillåter lipid diffusivitet som skall mätas genom att spåra flera enda lipid fluoroforer efter frigivningen i SBL för varje fusion händelse ^26. Storleken på varje fusing vesikelkan uppskattas ²⁷ genom att kombinera (i) intensiteten av en enda lipid färgämne, (ii) förändring av det totala fluorescens runt en dockningsområdet efter det alla fluoroforer överförs till SBL upon fusion, (iii) den kända märkningsdensitet av SUV lipider, och (iv) området per lipid. För många fusion händelser, var de faktiska lipid frisättningstider visat sig vara mycket långsammare än väntat genom diffusion-kontrollerad frisättning ^27, som noterades tidigare antagande enhetlig SUV storlek ^44. Förutsatt fördröjning av lipid frisättning beror på pore flimmer, gör en kvantitativ modell uppskattning av "pore öppenhet", den del av tiden porerna förblir öppen under fusion ^27.

Närhelst praktiskt, är det viktigt att testa fusionsmekanismer med användning av både lipid- och lösliga innehåll etiketter. Till exempel kan lipid frisättning fördröjas av andra än por flimmer processer, såsom begränsning av lipid diffusion av snaran proteiner som omger than pore. Om så vore fallet, släpp sedan av innehållet skulle föregå frigörande av lipid etiketter, förutsatt att por är tillräckligt stor för att tillåta passage av lösliga sonder. En mer grundläggande brist i den strategi skulle kunna vara i antagandet att överföringen av märkta lipider till SBL sker genom en smal fusion por ansluter SBL till en vesikel som till stor del har behållit sin pre-fusion form. Lipid överföring till SBL kan också vara resultatet av en snabb utvidgning av fusions por med en åtföljande, extremt snabb kollaps av SUV i SBL membran, som föreslog tidigare på lipid släppuppgifter enbart ^29. Övervakning både lipid och innehåll släpper samtidigt visade det sig att många porer återförslutas efter att ha släppt alla sina fettetiketter, men behöll en del av deras lösliga last ^27. Detta tyder på att åtminstone vissa liposomer inte kollapsar in i SBL efter smältning, och att lipiden färgämnesöverföring in i SBL sker genom en fusion por. Dessutom, lIPID och innehåll frisättning inträffade samtidigt ^27, vilket gör det osannolikt att fördröjning av lipid frigör berodde på besvär av lipid diffusion av snaran proteiner omger por ^45.

En SUV-SBL fusionsprotokoll som inte övervaka lösliga innehåll frisättning har tidigare publicerats av Karatekin och Rothman ^25. Här är den senaste utvecklingen ingår, nämligen samtidig övervakning av lipid och innehåll släpper och uppskattning av SUV, lipid, och fusion pore egenskaper ^27. Protokollet börjar med instruktioner för framställning av de mikroflödesceller, tillverkade genom bindning av en poly (dimetylsiloxan) (PDMS) elastomer segmentinnehållande räfflor med ett täckglas ^25. Därefter framställning av v-SUV med både lipid och innehåll markörer förklaras. §§ 4 och 5 ger instruktioner för montering av mikroflödesceller, bildar SBLs in situ och kontroll av defekter och smidighet, införande VSUVS in flödescellerna och detektering av fusionshändelser. Avsnitt 6 innehåller instruktioner för dataanalys.

Protocol

1. Framställning av en PDMS block för att bilda mikroflödessystem kanal Figur 1. Mikroflödescell mall och PDMS-block förberedelse. (A) Konstruktion av en flödescell fyra kanaler som passar på en 24 x 60 mm täckglas (botten). Sex identiska mönster är anordnade att passa på en 10 cm kiselskiva (överst). (B) Skär ut block av cirka 5-8 mm tjocka PD…

Representative Results

SBL Kvalitet Det är mycket viktigt att kontrollera kvaliteten och fluiditet hos SBL före fusionsexperimentet. Fluorescensen vid botten, glassidan av en mikroflödessystem kanal bör vara enhetlig, utan några uppenbara defekter. Om en luftbubbla passerar även om kanalen, vanligtvis lämnar synliga ärr på SBL. Om det finns sådana storskaliga ärr / fel, inte använda den kanalen. Ibland SUV kan fastna på…

Discussion

Ett framgångsrikt genomförande av SUV-SBL fusion analys som beskrivs här beror kritiskt på flera viktiga steg, såsom funktionell beredning av proteiner i liposomer, få bra kvalitet SBLs, och välja rätt avbildningsparametrar för att detektera enstaka molekyler. Även om det kan ta lite tid och ansträngning för att lyckas, när analysen genomförs framgångsrikt, ger det en mängd information om fusionsprocess inte kan erhållas från någon annan in vitro fusionsanalys diskuteras i Introduktion. De ku…

Materials

Reagents
Milli-Q (MQ) water	Millipore
KOH	J.T. Baker	3040-05
Ethanol 190 Proof	Decon
Isopropanol	Fisher Chemical	A416P4
HEPES	AmericanBio	AB00892
Sodium Cholride (KCl)		AB01915
Dithiothreitol		AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	AmericanBio	AB00892
EGTA	Acros Organics	409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)			25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform	J.T. Baker	9180-01	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol	J.T. Baker	9070-03	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe	Hamilton	var. sizes	only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)	http://www.hamiltoncompany.com
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16×100 mm screw cap culture tube	Pyrex	70825-16	clean thoroughly, rinse with chloroform	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457	Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening	http://www.avantilipids.com/
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)		840035
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)		850804
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2		840046
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE		810145
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE		880130
cholesterol (ovine wool, >98%)		700000
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)	Molecular Probes	D-307		https://www.thermofisher.com/
Rotavapor R-210	Buchi	R-210	heat bath above Tm of lipids used	http://www.buchi.com/
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside	Affymetrix	0311	store at -20°C, let come to RT before opening	https://www.anatrace.com/
Shaker – Eppendorf Thermomixer R	Eppendorf			https://www.eppendorf.com/
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL	life technologies	66003		https://www.lifetechnologies.com/
Bio-Beads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	1523920		http://www.bio-rad.com/
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556		http://www.sigmaaldrich.com/
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	41121703		https://www.beckmancoulter.com/
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB	Molecular Probes	S-1307		https://www.thermofisher.com/
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	7372512		http://www.bio-rad.com/
Sepharose CL-4B	GE Healthcare	17-0150-01		http://www.gelifesciences.com/
SYPRO Orange Protein Gel Stain	Molecular Probes	S-6650	5,000X Concentrate in DMSO	https://www.lifetechnologies.com/
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS	Dow Corning	3097358-1004		http://www.dowcorning.com/
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover	Corning	3160-152		http://catalog2.corning.com/LifeSciences/
Hole puncher – Reusable Biopsy Punch, 0.75mm	World Precision Instruments	504529		http://www.wpi-europe.com/
Manual Hole Punching Machine	SYNEO	MHPM-UNV		http://www.syneoco.com/
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch		CR0350265N20R4	drill diameter: 0.9 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD	Cole-Parmer	06419-00	0.010" ID, 0.030" OD	http://www.coleparmer.com/
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD		95802-00	0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass -  cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D	Schott	1472305		http://www.us.schott.com/
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G		http://harrickplasma.com/
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body	Olympus	IX81		http://www.olympus-lifescience.com/en/
EM CCD camera	Andor	ixon-ultra-897		http://www.andor.com/
Thermo Plate, heated microscope stage	Tokai Hit	MATS-U52RA26		http://www.tokaihit.com/
1 ml hamilton glass syringes (4x)	Hamilton	81365		http://www.hamiltoncompany.com
syringe pump	kd Scientific	KDS-230		http://www.kdscientific.com/