مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
القامع الجينات السرطانية، البروتين p53، هو المنظم الأساسي لعدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج والشيخوخة 1. وهو مسؤول عن الحفاظ على الاستقرار الجيني، وبالتالي من الأهمية بمكان للحفاظ على التوازن من موت الخلايا ونمو الخلايا. الطفرات في البروتين p53 شائعة في حالات السرطان وهي السبب الرئيسي لتعطيل البروتين p53 مما يؤدي إلى الخلايا السرطانية غير المنضبط انتشار 2. ومن المثير للاهتمام، والطفرات في البروتين p53 فقط لحساب ما يقرب من 25٪ من سرطانات الثدي 3، مما يوحي بأن آليات أخرى مسؤولة عن فقدان وظيفة البروتين p53. وقد أظهرت الإسوية البروتين p53 اكتشفت مؤخرا أن overexpressed في عدد من السرطانات البشرية، ويمكن أن تعدل وظيفة البروتين p53 4،5. لقد أظهرنا سابقا أن الإسوي البروتين p53، Δ40p53، هو الإسوي أكثر أعرب غاية في سرطان الثدي، وupregulated بشكل كبير في خلايا سرطان الثدي، بالمقارنة مع TISS المجاور الطبيعيرق 6. وفي أعقاب ذلك، نحن transduced ستابلي خط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF-7 إلى بإفراط Δ40p53 باستخدام ليغو-iG2-بورو + ناقلات (GFP +) 7. وقد استخدمت هذه الخلايا للتحقيق إذا عالية التعبير Δ40p53 يزيد معدلات تكاثر الخلايا في خلايا سرطان الثدي.
هناك العديد من الأساليب المباشرة وغير المباشرة لقياس انتشار الخلايا من الخلايا المستزرعة في المختبر 8،9. هذه لا يمكن أن يؤديها إما القياسات المستمرة مع مرور الوقت، أو المقايسات كما نقطة النهاية 10. الأساليب التقليدية لا تزال مفيدة، مثل عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. هذا الاختبار هو التكلفة المنخفضة ومقياسا مباشرا لعدد الخلايا، ولكنها لا تعتمد على عدد الخلايا الكبيرة وتدريب ذوي المهارات العالية لتقليل الخطأ ومستوى كبير الانحرافات من التهم الموجهة إليه. وقد أدت الحاجة إلى إجراء قياسات متوافقة مع صيغ الإنتاجية العالية لتطوير المقايسات multiwell لوحة. هذه المقايسات القائم على التألق قنينةإعادة أعداد الخلايا بناء على إشارة الانارة التي تتناسب مع النشاط الأيضي للخلية 11،12. وفي الآونة الأخيرة، سمحت بإدخال منصات التصوير نسبة عالية فيما يخص الأدوات الجديدة التي تراقب انتشار الخلايا في الوقت الذي توفر جمع البيانات المظهرية الكمي والنوعي، ويتضمن مجموعة متنوعة من أنظمة 13. كل من هذه الأساليب توفير السبل لقياس نمو الخلايا، إما عن طريق قياس أو نقطة النهاية فحوصات مستمرة، وتملك كل مجموعة من المزايا والعيوب فيما يتعلق حساسية، مرت من أعداد العينات، والمعلومات الخلية، والتي يمكن أن يكون وزنه وفقا لذلك اعتمادا على سؤال البحث.
يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في المختبر، مع كل طريقة استخدام نطاقات مختلفة من الحساسية، واستنساخ وصيغ لوحة متعددة أيضا. هذا البروتوكول يهدف إلى المقارنة بين استخدام تشا العد عدادة الكرياتmber، وبقاء الخلية فحص القائم على التألق، وتصوير الخلية، في قياس انتشار الخلايا على دوام 96 ساعة. للقيام بذلك، وتمت مقارنة نمو الخلايا transduced متجه (قدم مكعبة-7-ليغو) إلى خلايا transduced إلى بإفراط Δ40p53 (قدم مكعبة-7-Δ40p53)، وذلك باستخدام ثلاث كثافات مختلفة من الخلايا. وقد تم قياس انتشار الخلايا كل 24 ساعة لمدة تصل إلى 96 ساعة. تم العثور على كل أسلوب لديها مزايا وعيوبه، وهذا يتوقف على الهدف من التجربة، كل ما زالت هي طريقة قيمة لتوفير المعلومات عن معدل انتشار.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول تم فحص ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في الخلايا المستزرعة. كان كل طريقة قادرة على قياسات متكررة ودقيقة من تكاثر الخلايا أكثر من 96 ساعة، وكانت النتائج مماثلة بين كل من طرق اختبار (الشكل 2 و 3). كلا الفحص القائمة على التألق وطريقة التصوي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
