This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
הגן מדכא גידולים, p53, הוא הרגולטור חיוני של מספר תהליכים תאיים, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס והזדקנות 1. הוא אחראי על שמירה על יציבות גנומית, ולכן הוא חיוני בשמירה על האיזון של מוות של תאים וצמיחת תא. מוטציות ב- p53 נפוצים סרטן והם הגורם העיקרי של איון p53 המוביל התפשטות תאים סרטניים בלתי מבוקרת 2. מעניין, מוטציות ב- p53 רק מהווים כ -25% ממקרי סרטן השד 3, דבר המצביע על כך מנגנונים אחרים אחראים אובדן תפקוד p53. Isoforms p53 גילה לאחרונה הוכח להיות ביטוי יתר במספר סוגים של סרטן אנושי, והוא יכול לווסת p53 פונקצית 4,5. הראינו בעבר כי איזופורם p53, Δ40p53, הוא איזופורם הביע הגבוהה ביותר בסרטן השד, והוא upregulated משמעותי בתאי סרטן השד, בהשוואה Tiss נורמלי סמוכיםue 6. בעקבות זאת, אנחנו transduced הקו הסלולרי סרטן השד האנושי ביציבות MCF-7 כדי overexpress Δ40p53 באמצעות לגו-iG2-פורו + וקטור (+ GFP) 7. תאים אלו שמשו לחקור אם ביטוי Δ40p53 גבוה מגביר את קצב התפשטות תאים בתאי סרטן השד.
ישנן שיטות ישירות ועקיפות רבות של מדידת תא התפשטות של תאים בתרבית במבחנה 8,9. אלה יכולים להתבצע גם כמו מדידה רציפה לאורך זמן, או מבחני סיום כמו 10. בשיטות מקובלות עדיין שימושיות, כגון ספירת תאים באמצעות hemocytometer. assay זוהי עלות נמוכה מדידה ישירה של המספר הסלולרי, אבל זה להסתמך על ספירה תאית גדולה אימון מיומן כדי למזער סטיות שגיאת תקן גדול מן הספירות. הצורך לבצע מדידות תואמות פורמטי תפוקה גבוהה הוביל את הפיתוח של מבחני multiwell צלחת. מבחני הארה מבוססת אלה צפחותמחדש מספרים סלולריים המבוססים על אות זורחת כי היא יחסית את הפעילות המטבולית של התא 11,12. ולאחרונה, את ההקדמה של פלטפורמות הדמיה תכולה גבוהה אפשרה כלים חדשים אשר לנטר התפשטות תאים תוך מתן איסוף נתונים פנוטיפי כמותיים ואיכותיים, וכולל מגוון רחב של מערכות 13. כל השיטות האלה לספק אפיקים למדוד צמיחת תאים, בין אם על ידי מבחני מדידה או נקודות קצה רציפים, וכל אחד להחזיק מגוון של יתרונות וחסרונות לגבי רגישות, תפוקה של מספרי מדגם, ומידע תא, כל מה שיכול להישקל בהתאם בהתאם על שאלת המחקר.
פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה, עם כל שיטת ניצול טווחים שונים של רגישות, שחזור ותבניות צלחת רבה היטב. פרוטוקול זה נועד להשוות את השימוש של צ'ה ספירת hemocytometermber, assay כדאיות התא מבוססי הארה, וכן imager התא, במדידה של התפשטות תאים על פני מהלך הזמן 96 שעות ביממה. לשם כך, את הצמיחה של תאים transduced וקטור (MCF-7-לגו) הושווה תאים transduced כדי overexpress Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), באמצעות שלוש צפיפויות תאים שונים. התפשטות תאים נמדדה כל 24 שעות עד 96 שעות. לכל שיטה נמצאה יש יתרונות וחסרונות משלו, בהתאם מטרת הניסוי, כל עוד הוא שיטה ערך למתן מידע על קצב הפרוליפרציה.
בפרוטוקול זה בשלוש שיטות שונות של מדידת התפשטות תאים בתאים בתרבית נבדקו. לכל שיטה הייתה מסוגלת מדידות לשחזור המדויקות של התפשטות תאים מעל 96 שעות, והתוצאות היו דומות בין כל אחת מהשיטות שנבדקו (איור 2 ו -3). הן assay ושיטת הדמית תא מבוסס ההארה הפיקו את התוצאות החזקו…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |