Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Ген – супрессор опухолей р53, является существенным регулятором ряда клеточных процессов, в том числе остановки клеточного цикла, апоптоза и старении 1. Он отвечает за поддержание стабильности генома, и, следовательно, имеет решающее значение для поддержания баланса гибели клеток и роста клеток. Мутации в p53 являются общими в рак и являются основной причиной инактивации р53 приводит к пролиферации клеток рака неконтролируемое 2. Интересно отметить , что мутации в р53 составляют лишь около 25% случаев рака молочной железы 3, предполагая , что другие механизмы ответственны за потерю функции р53. Недавно открытые изоформы р53 , как было показано быть избыточно экспрессируется в ряде злокачественных опухолей человека, и могут модулировать функцию p53 4,5. Ранее мы показали, что р53 изоформы, Δ40p53, является самым высоким уровнем экспрессии изоформ при раке молочной железы, а также значительно усиливает свою активность в клетках рака молочной железы, по сравнению с нормальными смежного TISS6 уе. Вслед за этим, мы стабильно трансдуцированная человеческой линии клеток рака молочной железы MCF-7 гиперэкспрессией Δ40p53 с использованием Лего-IG2-Puro + вектор (GFP +) 7. Эти клетки были использованы для исследования, если высокий уровень экспрессии Δ40p53 увеличивает скорость пролиферации клеток в клетках рака молочной железы.
Есть много прямых и косвенных методов измерения клеточной пролиферации культивируемых клеток в пробирке 8,9. Они могут быть выполнены либо в виде непрерывных измерений с течением времени, или в качестве конечной точки анализов 10. Обычные методы по-прежнему полезны, например, подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Этот анализ является низкая стоимость и прямой мерой числа клеток, но он полагается на больших кровяных клеток и высококвалифицированной подготовки для минимизации ошибок и больших стандартных отклонений от подсчетов. Необходимость проведения измерений, совместимых с форматами высокой пропускной способности привело к разработке анализов многоямный тарелками. Эти люминесценции на основе анализов колбыRe числа клеток на основе сигнала , люминесцентный , который пропорционален метаболической активности клетки 11,12. Совсем недавно, введение платформ формирования изображений с высоким содержанием позволило новых инструментов , которые контролируют пролиферацию клеток, обеспечивая количественный и качественный сбор фенотипических данных, и включает в себя множество систем 13. Все эти методы обеспечивают пути для измерения роста клеток, либо путем непрерывного измерения или конечных точек анализов, и каждый обладает целым рядом преимуществ и недостатков в отношении чувствительности, пропускная способность номера образцов, а также информацию ячейки, все из которых могут быть весила соответствующим образом в зависимости на вопрос исследования.
Этот протокол описывает три различных метода измерения пролиферации клеток в пробирке, с каждым способом , использующим различные диапазоны чувствительности, воспроизводимости и многолуночных форматов пластин. Этот протокол направлен сравнить использование подсчета гемоцитометр CHAmber, жизнеспособность клеток анализ на основе люминесценции, а ячейка тепловизор, при измерении пролиферации клеток с течением времени курс 96 часов. Для этого, рост вектор-трансдуцированных клеток (MCF-7-Лего) сравнивали с клетками трансдуцированных что экспрессия Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), с использованием трех различных плотностей клеток. пролиферации клеток измеряли каждые 24 ч в течение до 96 часов. был найден Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от цели эксперимента, каждый по-прежнему является ценным методом для предоставления информации о скорости пролиферации.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе были рассмотрены три различных метода измерения пролиферации клеток в культуре клеток. Каждый метод был способен воспроизводимые и точные измерения пролиферации клеток в течение 96 часов, а результаты были сравнимы между каждым из методов тестируемых (рис 2 и 3).</stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
