乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
腫瘍抑制遺伝子は、p53は、細胞周期停止、アポトーシス及び老化1を含む細胞プロセスの多数の重要な調節因子です。これは、ゲノムの安定性を維持する責任があり、したがって、細胞死と細胞増殖のバランスを維持するために重要です。 p53の突然変異は、癌において一般的であり、制御されていない癌細胞の増殖を2につながるp53の不活性化の主な原因です。興味深いことに、p53の中の変異は、唯一の他のメカニズムがp53機能の喪失の原因であることを示唆し、乳癌3の約25％を占めています。最近発見されたp53のアイソフォームは、ヒト癌の多数において過剰発現されることが示されており、p53機能4,5を調節することができます。我々は、p53のアイソフォーム、Δ40p53は、乳癌において最も高度に発現されるアイソフォームであることが以前に示されており、正常な隣接TISSと比較した場合に有意に、乳癌細胞において上方制御されますUE 6。その後、我々は、安定レゴ-IG2-puroを+ベクターを用いΔ40p53（GFP +）の7を過剰発現するMCF-7ヒト乳癌細胞株を形質導入しました。これらの細胞は高いΔ40p53発現が乳癌細胞の細胞増殖率を増加させるかどうかを調べるために使用しました。
インビトロ 8,9 で培養した細胞の細胞増殖を測定する多くの直接的及び間接的な方法があります。これらは、時間の経過とともに連続測定として、またはエンドポイントアッセイ10のいずれかに行うことができます。従来の方法は、血球計数器を用いて細胞計数として、依然として有用です。このアッセイは、低コストと細胞数の直接の尺度であるが、それは数からの誤差と大きな標準偏差を最小にするために大規模な細胞数と高度に熟練した訓練に依存しません。ハイスループットフォーマットと互換性のある測定を行う必要がマルチウェルプレートアッセイの開発につながっています。これらの発光ベースアッセイmeasuセル11,12の代謝活性に比例する発光シグナルに基づいて、細胞数の再。より最近では、高含量のイメージングプラットフォームの導入は、定量的及び定性的な表現型データ収集を提供しつつ、細胞増殖をモニターする新しいツールを許可し、システム13の様々な含まれています。これらの方法の全ては、連続測定またはエンドポイントアッセイのいずれかによって、細胞増殖を測定するための手段を提供し、それぞれの感度、サンプル番号のスループット、およびセル情報に関して利点と欠点の範囲を有し、によって適宜計量することができるすべてが研究の質問に。
このプロトコルは、それぞれの方法は、感度、再現性、およびマルチウェルプレートフォーマットの異なる範囲を用いて、in vitroで細胞増殖を測定するための3つの異なる方法を記載しています。このプロトコルは、茶をカウント血球計数器の使用を比較することを目的としましたmber、96時間の時間経過にわたって細胞増殖の測定における発光に基づく細胞生存率アッセイ、および細胞イメージャ。これを行うには、ベクター形質導入細胞（MCF-7-LEGO）の成長は、3つの異なる細胞密度を使用して、Δ40p53（MCF-7-Δ40p53）を過剰発現するように形質導入された細胞と比較しました。細胞増殖は、最大96時間ごとに24時間測定しました。それぞれの方法は、それ自身の利点と欠点を有することが見出され、実験の目的に応じて、各々が依然として増殖の速度についての情報を提供するための有益な方法で行いました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、培養細胞における細胞増殖を測定する3つの異なる方法を検討しました。それぞれの方法は、96時間にわたる細胞増殖の再現性と正確な測定が可能であった、その結果は（ 図2及び3）試験方法の各々の間で同等でした。発光ベースのアッセイ及び細胞イメージング法の両方が、96時間後の細胞増殖の線形増加を示し、最も堅牢な結果が得られた（ 図<stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
