Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

Het onderzoek van weefsels, organen of systemen in vitro is een poging om de complexe relaties die bestaan ​​tussen de verschillende cellulaire subtypen die meercellige organismen omvatten vereenvoudigen. Inderdaad, in vitro studies maken het mogelijk een gedetailleerd inzicht cel populaties te verkrijgen. Er zijn twee belangrijke voordelen van het uitvoeren van in vitro experimenten: 1) verminderde cellulaire interacties, en 2) het vermogen om eenvoudig te manipuleren cellulaire omgeving. Vandaar dat deze twee voordelen toegestaan ​​wetenschappers om het gedrag van specifieke celtypen in vivo te voorspellen, waardoor het vermogen om resultaten van extrinsieke invloeden gehele organismen te reguleren. In die zin, in vitro celkweek werkt vaak als een brug tussen fundamenteel en toegepast life sciences. Toch zijn er ook een aantal nadelen van het werken in vitro, het belangrijkste is dat een bepaalde reservering kan wonen in de fysiologischeal relevantie van de waargenomen fenotypes. Inderdaad, als een enkel type cel wordt gekweekt in een vat, de cultuur verliest, een verschillende mate, de cel-cel verbindingen met andere celtypen, zijn bijdrage aan de humorale milieu uit het weefsel en het organisme van herkomst, en de ankers binnen het weefsel dat het nodig om een ​​bepaalde driedimensionale structuur soms cruciaal voor celfunctie te handhaven.

De kwestie van cel-cel verhoudingen is aangepakt door de ontwikkeling van gemengde kweektechnieken. In deze werkwijze worden twee of meer celpopulaties vergroeid in dezelfde kweekvat. Echter, deze gemengde culturen dragen belangrijk ongemakken. Aan de ene kant, sommige cel subtypes niet fysiek met elkaar in het weefsel van herkomst en alleen vertrouwen op paracriene communicatie ondersteund door afgescheiden oplosbare factoren en de nabijgelegen receptoren. Dit geldt voor verschillende inflammatoire processen die afhankelijk proximale cytokine signaling. In gemengde cultures, fysische interacties onvermijdelijk en het onmogelijk maken om paracriene communicatie in de afwezigheid van cel-cel contacten die veranderde resultaten kan opleveren bestuderen. Anderzijds, bereiken celspecifieke interpretaties binnen een gemengde populatie wordt haalbaar zonder het gebruik van agressieve scheidingstechnieken die significante resultaten kunnen beïnvloeden.

Om deze belangrijke kwesties op te lossen is het gebruik van geconditioneerde media ontwikkeld als een techniek waardoor gecompartimenteerd culturen en de studie van paracrienen. Deze methode vereist de overdracht van het supernatant van een celtype, waardoor een genoemde geconditioneerd medium aan putjes met een celpopulatie. Nog een belangrijk nadeel is dat kortstondige moleculen niet lang genoeg overleven in het geconditioneerde medium worden overgebracht naar de putjes van de tweede populatie cellen. Zelfs langlevende moleculen zal sterk worden verdund na verloop van tijd als gevolg van diffusie. Voorts beide cellijnenpopulaties alleen deelnemen aan één richting paracriene communicatie in plaats van in actieve bi-directionele communicatie. Dit leidt tot het ontbreken van feedback signalering die essentieel herscheppen nauwkeurig meercellige verhoudingen zoals deze in vivo.

Bijgevolg en gedreven door de behoefte aan een betere simulatie van de oorspronkelijke in vivo omstandigheden in de in vitro cellulaire omgeving zijn verschillende ontwikkelingen in celkweek technieken resultaten van het jaar. Eén van de belangrijkste verbeteringen is het gebruik van doorlaatbare dragers met microporeuze membranen voor compartimentering celculturen voor het eerst Grobstein is in 1953 ^1. Dergelijke doorlaatbare dragers zijn afgestemd op de jaren vele celtypen te vangen en te gebruiken in verschillende toepassingen. Tegenwoordig zijn deze dragers bestaan ​​als holle inzetstukken die zijn ontworpen in putten uit te rusten van een multiwell weefselkweek plaat of in circuLAR gerechten. In een co-kweeksysteem, het inzetstuk bevat één celtype dat de put of schaal bevat andere celpopulatie, waardoor de bijdrage van twee verschillende populaties van cellen te bestuderen hun humorale milieu (figuur 1). Hierdoor wordt cellulaire polariteit (basolaterale vs apicale uitscheiding of signaalontvangst) bewaard, en daarmee in insert co-kweeksystemen een belangrijk voordeel ten opzichte van gemengde kweken en geconditioneerd medium technieken. Verschillende soorten membraanmaterialen zijn, de meest voorkomende zijn polyester (PET), polycarbonaat (PC) of met collageen beklede polytetrafluorethyleen (PTFE), en deze in verscheidene poriëngrootte variërend van 0,4 urn tot 12,0 urn. Deze soorten materialen en poriegroottes bieden een spectrum inzetstukken uitoefenen variabele kenmerken aan optische eigenschappen, membraandikte en celhechting die hen praktisch gedifferentieerd naar de volgende te vormen van gebruik niet beperkt tot:
-Studieceldifferentiatie, embryonale ontwikkeling, tumor metastase en wondheling door chemotaxische testen door middel doorlaatbare membranen;
-Evaluatie drug penetratie door de beoordeling van hun transport door epitheliale of endotheliale monolagen gekweekt op doorlatende steunen, en;
-performing cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren.

Het doel van dit artikel is het algemene methodologische richtlijnen beschrijven de derde functie hierboven vermeld, dat wil cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact met een insert co-kweeksysteem evalueren vervullen. Er zijn verschillende gebieden van het onderzoek gebruik maken van insert co-cultuur systemen om vragen aan het effect van de afgescheiden oplosbare factoren op populaties van cellen relevant te beantwoorden. Inderdaad, paracrienen die celgedrag moduleert op verschillende niveaus relevant is in alle weefselsen systemen, die insert co-cultuur systemen maakt onmisbaar voor de vooruitgang op deze gebieden te waarborgen. Omgekeerd, het gebruik van inzetstukken die signaaltransductie bevestigen is door direct contact cel-cel en niet van uitgescheiden factoren. Een van de belangrijkste toepassingen van inserts in ontsteking ^2-14 studies waarbij het ​​effect van uitgescheiden cytokinen wordt geëvalueerd in verschillende cellulaire spelers van immuniteit. In het bijzonder is de studie van een ontsteking in het centrale zenuwstelsel (CNS) sterk profiteerde van insert co-cultuur studies, die hebben toegestaan ​​om beter te definiëren de verschillende paracriene rollen van neuronen en de microglia in het besturen neuroinflammatie ^15-21. Deze systemen werden ontwikkeld om de anti-inflammatoire potentieel van moleculen die is gebaseerd op hun vermogen te verminderen of remmen de secretie van pro-inflammatoire factoren ^22-26 bestuderen. Onderzoek met betrekking tot kanker ^27-31, in het bijzonder de mechanismen die ten grondslag liggen aan angiogenese ^32-34 en inflammatiop ^35-42 in het ontstaan ​​van tumoren, profiteert ook van insert co-cultuur systemen. Bovendien zijn oplosbare factoren zijn van groot belang in de processen die rijden differentiatie en verschillende studies hebben inserts gebruikt om te vragen op dat gebied ^43-50 te beantwoorden. In het CZS, aangezien neuraal weefsel heeft een zeer beperkte vernieuwend vermogen, de studie van neurotrophism en neuroprotectie is fundamenteel en is algemeen gewaarborgd door het gebruik van stamcellen in co-kweeksystemen ^51-56. Daarnaast worden inserts ook gebruikt in diverse gebieden als nefrologie ^57,58, endotheliale interacties en ^59-62 angiogenese, apoptose signalering ^63-65, ontsteking in obesitas en metabool syndroom ^22,23,66-67, binnenoor beschermen haarcellen ^68,69, en zelfs in schimmels virulentie ^70,71 en parasitologie ^72,73.

Dit artikel biedt algemene methodologische richtlijnen met het oog op het opzetten van een experiment gezien evalueren cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren afgescheiden middels een insert co-kweeksysteem. In het bijzonder zullen we onze aandacht richten op zenuwcel co-culturen en hun toepassingen in het bestuderen van neuro-inflammatoire proces. Gezien de zeer grote spectrum van experimenten die inserts mogelijk maken om piloot, het is ondraaglijk om elk aspect van deze celkweek techniek te dekken. Als voorbeeld, een specifiek protocol voor het meten van de effecten van cytokinen uitgescheiden door lipopolysaccharide (LPS) N9 geactiveerde microglia op neuronale PC12 cellen worden gedetailleerd, met een concreet inzicht insert co-kweek methode.

Protocol

NB: Elk van de volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap zoals vereist voor zoogdierlijke celkweek. Daarnaast is de algemene richtlijnen voor een optimale steriele cel teelt toe te passen, bv., Weggooien tips elk moment dat ze kunnen leiden tot kruisbesmetting, het verminderen van de hoeveelheid tijd die cellen worden blootgesteld aan de lucht bij het ​​uitvoeren van complete media verandert, behoren maar voorzichtig al roerend celsuspensies om hun homoge…

Representative Results

Het gebruik van co-insert kweeksystemen een bijzonder belang in de studie van neuro-inflammatoire processen die paracriene relatie tussen verschillende cellulaire spelers van het CZS demonstreren. Immuniteit in het CZS wordt voornamelijk bereikt door resident microglia cellen genaamd hun omgeving in hun vertakte rustende toestand (figuur 2A) volgen en kunnen sensing verstoringen die kunnen problemen de kostbare homeostase vlot te neuronale functie 76-78. Micro…

Discussion

De meest kritische stap van een insert co-kweeksysteem experiment eigenlijk woont in het kiezen van de juiste insert te gebruiken. Poriegrootte en membraanmateriaal moet rekening gehouden worden grondig, zonder te vergeten het type cellen die worden gezaaid en het doel van het experiment onderzocht. Bijvoorbeeld kan chemotaxische assays hetzelfde type membraan gebruikt dan cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren. Echter, be…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum