Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hämatopoese ist ein komplexer Prozess , bei dem Entwicklungs hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) vorhanden hemogenic Endothel abgeschnürt in einer Vielzahl von embryonalen hämatopoetischen Stätten wie die Aorta-Gonad-Mesonephros und der Plazenta 1,2. Die Unfähigkeit zur Kultur HSCs in vitro verhindert , dass die eingehende Analyse dieses Prozesses sowie die klinische Anwendung dieser Studien. Zur Umgehung dieser Einschränkung, frühere Studien haben versucht abzuleiten HSZ de novo entweder über die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) 3, oder induzierte Plastizität in somatischen Zellen und gerichtete Differenzierung mit Neuprogrammierung Medien 4,5. Diese Studien jedoch erzeugen keine klinisch sicher engraftable Zellen oder erlauben Studie der endgültigen Entwicklung Hämatopoese "in einer Schale."
Das neue Werk von Yamanaka etabliert und Kollegen pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Fibroblasten p induziert zu erzeugen,rovides einen Rahmen für die Transkriptionsfaktor (TF) basierend Überexpression Strategien in Reprogrammierung des Zellschicksals 6,7. Diese Arbeit hat aufgefordert, die Ermittler in mehreren Bereichen Zelltypen der Wahl über TF Reprogrammierung von leicht zugänglichen somatischen Zellen zu erzeugen. Das Ziel der hier beschriebenen Umprogrammierung Strategie ist eine hemogenic Prozess von Maus somatischen Zellen zu induzieren , unter Verwendung eines TF basierend Umprogrammierung Ansatz mit dem Ziel , diese Erkenntnisse auf das menschliche System des Übersetzens patientenspezifischen Fibroblasten um umprogrammieren humanen Hämatopoese in vitro zu studieren und erzeugen patientenspezifische Blutprodukte für Krankheitsmodelle, Drogentests und Stammzelltransplantation.
Der erste Schritt richtige Umprogrammierung in diesem Maus-System, um sicherzustellen, war ein Reporter Linie zu entwickeln, die als Auslese für CD34-Expression, ein bekannter Marker in endothelialen Vorläuferzellen und HSZ serviert. Dazu wurden die huCD34-tTA und TetO-H2BGFP transgene Mauslinien verwendet, um generate doppelt transgenen embryonalen Maus – Fibroblasten (MEF), bezeichnet nun 34 / H2BGFP, die 8 bei Aktivierung des CD34 – Promotors grün fluoreszieren. Dies erlaubt Screenen einer Vielzahl von TFs bekannt an verschiedenen Punkten während des hämatopoetischen Spezifikation und Entwicklung benötigt werden. Beginnend mit 18 TFs in pMX retrovial Vektoren (bestimmt durch die Literatur Bergbau und Profilierung von GFP etikettenhalt HSZ aus dem zuvor 34 beschrieben / H2BGFP Mäuse), 34 / H2BGFP MEFs wurden transduziert mit allen Faktoren und kultiviert auf AFT024 HSC tragende Stromazellen. Nach der Erkennung von 34 / H2BGFP Aktivierung wurde identifiziert TFs wurden anschließend von der Umprogrammierung Cocktail bis die optimale Menge von TFs für Reporter Aktivierung entfernt. Nach diesem ersten Bildschirm wurden die Faktoren, die zu einem DOX induzierbaren pFUW Vektorsystem übertragen steuerbaren Expression der TFs zu ermöglichen. Da diese beiden DOX steuerbare Systeme inkompatibel sind (die 34 / H2BGFP Zellen und die pFUW induzierbarer Vektoren), MEFs ausWildtyp C57BL / 6-Mäuse wurden erforderlich. Es war auch notwendig, eine geeignete Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen hemogenesis fortzufahren und schaffen multilineage clonogene Vorläufern zu ermöglichen.
Aktuelle Studien somatischen Zellen in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) haben vielfältige Erfolgsstufen 9-11 erfüllt umprogrammieren versuchen. Bis heute ist die Erzeugung von Maus und Mensch transplantierbaren HSPCs mit langfristigen und sich selbst erneuernde repopulating Fähigkeit wurde mit dem gleichen Satz von TFs nicht erreicht. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung der zuvor festgelegten Strategie zu reproduzierbar hemogenesis MEFs induzieren. Wir zeigen , dass die Einführung eines minimalen Satz von TFs (GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6) ist in der Lage ein komplexes Entwicklungsprogramm in vitro angestiftet , die eine Plattform kann weiter durch die Entwicklung der Hämatopoese und klinische Anwendung von hämatopoetischen Neuprogrammierung bietet 12 untersucht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erzeugen HSPCs de novo aus leicht erreichbar somatischen Zellen bietet eine einzigartige Methode der Hämatopoese in vitro zu untersuchen und die Möglichkeit, potentiell diese Technologie auf das menschliche System anzuwenden. Diese Übersetzung würde ein neues Werkzeug zu studieren menschliche hämatologische Erkrankung in einer Schale zu erzeugen, sowie Drogentestplattformen und Gen-Targeting-Möglichkeiten bieten zu zahlreichen Erkrankungen mit neuartiger Therapeutika oder HSC-Transplantationen be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
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