The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Hematopoiesis er en kompleks utviklingsprosess der blodkreft stamceller (HSCs) knopp av hemogenic endotelet til stede i en rekke embryonale blodkreft steder som Aorta-Gonade-Mesonephros og morkaken 1,2. Den manglende evne til kulturen HSCs in vitro hindrer grundig analyse av denne fremgangsmåten, så vel som den kliniske anvendelsen av disse studiene. For å omgå denne begrensningen, har tidligere studier forsøkt å utlede HSCs de novo enten via differensiering av pluripotente stamceller (PSC avtaler) 3, eller indusert plastisitet i somatiske celler og rettet differensiering ved hjelp omprogrammering medier 4,5. Disse studiene har imidlertid ikke generere klinisk trygge engraftable celler eller tillate studie av definitive utviklings hematopoiesis "i en skål."
Romanen arbeid etablert av Yamanaka og kolleger til å generere induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra somatisk fibroblaster provides et rammeverk for transkripsjon faktor (TF) basert overekspresjon strategier i omprogrammering celle skjebne 6,7. Dette arbeidet har bedt etterforskerne på flere områder for å generere celletyper av valg via TF omprogrammering av lett oppnåelig somatiske celler. Målet med reprogrammerings strategien som er beskrevet her er for å indusere en hemogenic prosess fra musesomatiske celler ved hjelp av et TF basert reprogrammerings tilnærming med det mål å oversette disse funnene til det menneskelige system for å omprogrammere pasientspesifikke fibroblaster for å undersøke human hematopoese in vitro og generere pasientspesifikke blodprodukter til sykdom modellering, narkotika testing, og stamcelletransplantasjon.
Det første skrittet for å sikre riktig omprogrammering i denne musen systemet var å utvikle en reporter linje som fungerte som en lese-out for CD34 uttrykk, et kjent merke i endoteliale progenitorceller og HSCs. For å gjøre dette, ble de huCD34-TTA og Teto-H2BGFP transgene mus linjer som brukes til å generate doble transgene mus embryonale fibroblaster (MEFs), nå betegnet 34 / H2BGFP, som fluoresce grønt ved aktivering av CD34 arrangøren 8. Dette tillot screening av et utvalg av TFS som er kjent for å være nødvendig ved forskjellige punkter i løpet av hematopoetiske spesifikasjon og utvikling. Fra og med 18 TFS i PMX retrovial vektorer (bestemt gjennom litteratur gruvedrift og profilering av GFP etikett beholde HSCs fra de tidligere omtalte 34 / H2BGFP mus), 34 / H2BGFP MEFs ble omformet med alle faktorer og kultivert på AFT024 HSC-støtte stromale celler. Etter påvisning av 34 / H2BGFP aktivering, ble TF'er deretter fjernet fra reprogrammerings-cocktail inntil den optimale settet med TFS for reporter-aktivering ble identifisert. Etter denne startbildet, ble faktorer overført til en DOX induserbar pFUW vektorsystem for å tillate kontrollerbar ekspresjon av TFS. Siden disse to DOX kontrollerbare systemer er uforenlig (de 34 / H2BGFP celler og pFUW induserbare vektorer), MEFs fravilltype C57BL / 6 mus ble nødvendig. Det var også nødvendig å gi en passende mikromiljøet for å tillate hemogenesis å fortsette og lage multilineage klonogene stamfedre.
Aktuelle studier som forsøker å omprogrammere somatiske celler i hematopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) har møtt ulike nivåer av suksess 9-11. Til dags dato har generering av både mus og mennesketrans HSPCs med langsiktig og selvfornyende repopulating evne ikke er oppnådd ved hjelp av det samme settet av TFS. I denne protokollen, gir vi en detaljert beskrivelse av tidligere etablert strategi for å reproduserbart indusere hemogenesis i MEFs. Vi viser at innføring av et minimalt sett med TFS (Gata2, Gfi1b, cFos, og Etv6) er i stand til å sette i gang en kompleks utviklings program in vitro som gir en plattform der utviklings hematopoiesis og klinisk anvendelse av blodkreft omprogrammering kan bli ytterligere undersøkt 12.
Generering HSPCs de novo fra lett oppnåelige somatiske celler tilbyr en unik metode for å studere hematopoiesis in vitro, og muligheten til å potensielt bruke denne teknologien til det menneskelige systemet. Denne oversettelsen vil generere et nytt verktøy for å studere menneskelig hematologisk sykdom i en skål, samt gi narkotika testing plattformer og genet målretting muligheter til å behandle en rekke lidelser med nye terapeutiske eller HSC transplantasjoner. I feltet, har nyere studier utvid…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
0.45uM filters | Corning | 430625 | |
Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
18G needles | BD | 305195 | |
20G needles | BD | 305175 | |
25G needles | BD | 305125 | |
Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
SCF | R & D Systems | 455-MC | |
Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
TPO | R & D Systems | 488-TO | |
Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
Gata2 | Origene | MR226728 | |
Gfi1b | Origene | MR204861 | |
cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
Etv6 | Origene | MR207053 | |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |