Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК – связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.
Многочисленные белки обозначены как ОДП в силу своих консервативных областей аминокислот, в том числе мотив распознавания РНК (RRM), двухцепочечной РНК – связывающий домен (РДО), и вытягивание основных остатков (например, аргинин, лизин, и глицин) 4. ОДП обычноизолированных стратегиями иммунопреципитационных и просеивают, чтобы идентифицировать их родственными РНК. Некоторые ОДП совместно регулируют пре-мРНК, функционально связанные, обозначенные как РНК регулонов 5-8. Эти ОДП, их родственными мРНК, а иногда и некодирующих РНК, образуют каталитические РНП, которые различаются по составу; их уникальность обусловлена различными комбинациями сопутствующих факторов, а также временной последовательности, расположения, и продолжительность их взаимодействий 9.
РНК иммунопреципитации (RIP) является мощным средством , чтобы изолировать РНП из клеток и выявления сопутствующих транскриптов с помощью анализа последовательности 10-13. Переход от кандидата к геному скрининг возможна через RIP в сочетании с микрочипов анализа 14 или высокой пропускной последовательности (Секвенирование РНК) 15. Точно так же, соосаждение белки могут быть идентифицированы с помощью масс – спектрометрии, если они достаточно обильны и отделим от совместным осаждением антителом 16,17. Здесь мы рассматриваем методику выделения RNP компонентов определенной родственным РНК из культивируемых клетках человека, хотя подход изменяемыми для растворимых лизатов клеток растений, грибов, вирусов и бактерий. Downstream анализ материала включают идентификацию кандидатов и проверку с помощью иммуноблот, масс – спектрометрии, биохимический анализ ферментативной, RT-КПЦР, микрочипов и Секвенирование РНК, как представлено на рисунке 1.
Учитывая фундаментальную роль RNPs в контроле экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, изменения в экспрессии компонентов ОДП или их доступности к родственным РНК может быть вредно для клетки и связаны с несколькими типами расстройств, включая неврологические заболевания 18. DHX9 / РНК хеликаза А (РГА) необходимо для перевода отдельных мРНК клеточных и ретровирусных происхождения 6. Эти родственными РНК обладают структурно-родственные элементы цис-действующие в рамках своих5 'UTR, который обозначается как пост-транскрипционном управляющего элемента (PCE) 19. РГА-PCE активность необходима для эффективной кэп-зависимой трансляции многих ретровирусов, в том числе ВИЧ-1, а также гены , регулирующие рост, в том числе Джунд 6,20,21. Кодируемый геном (эссенциальной dhx9), РГА имеет важное значение для клеточной пролиферации и его понижающей регуляции исключает жизнеспособность 22 клеток. Молекулярный анализ RHA-PCE РНП является важным шагом на пути к пониманию того, почему РГА-PCE деятельность необходимо контролировать клеточную пролиферацию.
Точная характеристика компонентов RNP РГА-PCE в стационарном состоянии или при физиологической возмущения клетки требует селективного обогащения и захвата из РГА-PCE RNPs в достаточном изобилии для анализа вниз по течению. Здесь, ретровирусный РНК PCEgag был помечен 6 копий сайта цис-связывания РНК для белка оболочки MS2 (СР) в пределах открытой рамки считывания. Белок оболочки MS2 был экзоgenously экспрессируется совместно с PCEgag РНК плазмиды трансфекции для облегчения сборки RNP в растущих клетках. RNPs , содержащие белок оболочки MS2 с родственным MS2-меченой РНК PCEgag подвергали иммунопреципитации из клеточного экстракта и захватили на магнитных шариков (рис 2а). Для выборочного захвата компонентов RNP, присоединенные к PCE, иммобилизованного РНП инкубировали с олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям дистальных к PCE, образуя гибрида РНК-ДНК, который является субстратом для активности РНКазы Н. Так как PCE позиционируется в 'терминале 5' 5'-нетранслируемой области, олигонуклеотид комплементарны последовательности РНК, смежных с ретровирусной сайта инициации трансляции (ГАГ старт-кодон). РНКазы H расщепления вблизи начала рвотным кодонов выпущен UTR комплекс 5 'от иммобилизованным RNP, который собирают в качестве элюента. После этого образец оценивали с помощью ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить захват PCEgag и с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, чтобы подтвердить captuповторно из белка оболочки мишени MS2. Валидация из PCE-ассоциированной РНК связывающего белка, DHX9 / РНК хеликаза А, затем выполняется.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.
Преимущество использования олиг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
