Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Masa utiliza citometría de anticuerpos conjugados con etiquetas de metales pesados, un enfoque que ha aumentado considerablemente el número de parámetros y oportunidades para el análisis profundo mucho más allá de lo que es posible con el flujo basado en la fluorescencia convencional citometría. Como con cualquier nueva tecnología, hay pasos críticos que ayudan a asegurar la generación fiable de datos de alta calidad. Se presenta aquí un protocolo optimizado que incorpora múltiples técnicas para el procesamiento de muestras de células para análisis de masas citometría. Los métodos descritos aquí ayudarán al usuario a evitar los errores comunes y lograr resultados consistentes al minimizar la variabilidad, que puede conducir a datos inexactos. Para informar el diseño experimental, la razón de pasos opcionales o alternativos en el protocolo y su eficacia en el descubrimiento de nuevos hallazgos en la biología del sistema que está siendo investigado está cubierto. Por último, los datos representativos se presenta para ilustrar resultados esperados de la Presente técnicasd aquí.

Introduction

Citometría permite la medición simultánea de múltiples objetivos de anticuerpos en un único nivel celular a través de grandes poblaciones de células. En tradicional citometría de flujo basada en fluorescencia, el número de parámetros que pueden cuantificarse está limitada por la superposición espectral entre el espectro de emisión de múltiples fluoróforos, que requiere cálculos de compensación cada vez más complejos como el número de parámetros aumenta. Estas limitaciones se abordan en masa citometría, donde se detectan y cuantifican por tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas para ampliar en gran medida el número de parámetros recogidos simultáneamente y producir un alto perfil de proteínas-abundancia dimensional para cada célula individual anticuerpos conjugados de metales pesados.

Un conocimiento básico del funcionamiento de los medios de citometría de instrumentos es beneficioso para el usuario y puede ser esencial para la resolución de problemas. Para una descripción más completa de ajuste y funcionamiento de una máquina de masa citometría,ver el manuscrito relacionado ^1. Brevemente, una muestra celular se marca con un panel de anticuerpos conjugados de metal de orientación marcadores de superficie celular, proteínas citoplásmicas, proteínas nucleares, proteínas de la cromatina unida u otros epítopos de interés (Figura 1i). Las células marcadas se cargan en la máquina, ya sea de una en una por inyección manual o el uso de un muestreador automático que las muestras de una placa de 96 pocillos. Las células cargadas se inyectan a través de un nebulizador, que genera una pulverización de gotitas líquidas que encapsulan las células (Figura 1ii). Este spray se coloca de modo que las células son ionizados por un soplete de plasma de argón. Esta ionización genera una nube de partículas comprendido de todos los átomos constituyentes de cada célula (Figura 1III). Como esta nube de partículas viaja al detector, átomos de baja masa atómica se separan de los altos iones de masas por un filtro de masas de cuadrupolo. Los iones de masas de alta restantes siguen el detector, donde el abundance de cada isótopo se cuantifica (Figura 1iv). Los datos brutos recogidos por el detector, son analizados por el software del instrumento de citometría de masas para identificar eventos celulares. Para cada evento célula identificada, la señal detectada en cada canal se cuantifica y se guarda en el archivo una salida .fcs. Los canales de masa utilizados para la detección de los anticuerpos de metales pesados ​​conjugados exhiben solapamiento espectral mínimo, que oscila de 0-4% con la mayoría de las contribuciones por debajo de 1%. Debido a esta baja diafonía entre canales, generalmente es innecesario para transformar los datos con una matriz de compensación antes del análisis ^2. Sin embargo, se debe tener cuidado durante el diseño del panel experimental de anticuerpos para garantizar que un anticuerpo con un epítopo de alta abundancia no se asigna a un canal de masa que contribuye señal a un canal asignado a un anticuerpo de baja abundancia, ya que puede crear una población artificialmente alta en el canal de recepción de la contribución de la señal.

<p clculo = "jove_content"> La preparación exacta de muestras para análisis de citometría de masa es altamente dependiente de los tipos de muestras que se recogió y la hipótesis experimental se está probando. Proporcionamos ejemplos de dos protocolos para la recolección de diferentes tipos de células (células madre embrionarias humanas) y células primarias (tumor de mama aislar de células epiteliales de ratón). Al comenzar un estudio de citometría de masas, es aconsejable llevar a cabo primero un pequeño experimento piloto para asegurar que todos los protocolos y los anticuerpos que se utilizarán están trabajando bien en manos del investigador. Esto es especialmente esencial cuando se van a utilizar anticuerpos conjugados de encargo, como la reacción de reducción parcial durante la conjugación de anticuerpos tiene el potencial de interrumpir la afinidad del anticuerpo; Por lo tanto, cada anticuerpo a medida necesita ser validado empíricamente para garantizar la exactitud de los datos. Otras consideraciones incluyen la determinación de si los anticuerpos de la superficie celular que se utilizarán en el ensayo reconocerá sus epítopos después de la fijación o si need a ser aplicado a células vivas. Algunos de fijación puede evitar la tinción adecuada con anticuerpos de la superficie celular como se sabe que ocurre con el péptido-MHC tinción ^{3, 4.} Realización de la tinción de anticuerpos de la superficie celular en células vivas puede ser necesario para algunos anticuerpos, pero esto excluye la opción de códigos de barras antes del marcaje de anticuerpos como la mayoría de los métodos de código de barras se realizan después de la fijación ^5, aunque el código de barras basado en anticuerpos ^{6, 7} es una excepción.

Al determinar el número de células que se preparó para el análisis, es importante saber que será detectado sólo una fracción de las células cargadas en la máquina y producir datos. Esta pérdida se debe principalmente a las ineficiencias cuando el nebulizador pulveriza de la muestra a la antorcha. La pérdida exacta ciento depende de la masa de citometría de configuración de la máquina y el tipo celular, pero puede variar de 50-85% y debe estarcuenta en el diseño del experimento. Este protocolo se ha optimizado para 2×10 ⁶ células por muestra, pero puede ser adaptado para el procesamiento de tamaños de muestra más pequeños o más grandes. Este protocolo se puede utilizar con modificaciones mínimas para tamaños de muestra de 1 x 10 ⁶ 4 x 10 ^6, sin embargo, es crítico que tamaño de la muestra se mantiene constante dentro de un experimento. Los cambios en el número de células pueden afectar a la intensidad de los códigos de barras y la tinción de anticuerpos y debe ser mantenido más o menos constante a través de muestras que deben compararse directamente.

Algunos procedimientos, como el etiquetado de células muertas y de marcaje de ADN, deberían llevarse a cabo en la gran mayoría, si no todos los diseños experimentales. El etiquetado de células muertas en los experimentos de análisis de marcadores de superficie sólo se puede lograr utilizando Rh103, pero Rh103 se debe evitar por experimentos en los que se requiere la permeabilización, que resultará en la pérdida de tinción. Para los experimentos que implican la permeabilización, es aconsejable utilizar cisplatino <shasta class = "xref"> 8 y, cuando sea posible, un anticuerpo que reconoce PARP exfoliados o exfoliados caspasa para detectar células apoptóticas y muertas.

Muestras de código de barras pueden reducir el consumo de anticuerpo, disminuir el tiempo de adquisición y eliminar de la muestra a muestra variabilidad ^9. El proceso de código de barras consiste en aplicar un código de muestra específica única para todas las células, que se utiliza para asignar a cada célula a su muestra de origen. Después de códigos de barras las muestras podrán mezclarse antes de la tinción de anticuerpo, un proceso que asegura todas las muestras se tiñen por igual. Para reducir al mínimo el error experimental, es prudente código de barras y Piscina ninguna de las muestras que van a ser directamente comparados entre sí. Actualmente existen varios métodos para códigos de barras muestras para análisis de citometría de masa ^{5, 6, 7,} dos de los cuales se presentan aquí (véase abajo).

Con reagen disponibles en la actualidadts es posible cuantificar la abundancia de 38 dianas de anticuerpos, identificar las células en la fase S ^10, distinguir las células vivas y muertas ⁸ y medir los niveles celulares de la hipoxia ¹¹ en un experimento de multiplexado de múltiples muestras. Esta capacidad de recoger datos de células individuales alta de parámetros para las poblaciones de células grandes permite mejorar de perfiles de poblaciones de células altamente heterogéneos y ya ha producido una serie de puntos de vista biológicos novedosos ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destilar los datos complejo resultante a la información interpretable ha requerido el uso de algoritmos computacionales incluyendo Spanning Tree progresión de la densidad de Eventos normalizada (SPADE) ¹⁷ y Visne ^18.

En este artículo se presenta un formato accesiblevisión general de cómo diseñar y llevar a cabo una masa citometría de experimento e introduce el análisis básico de datos de citometría de masas.

Protocol

1. La recolección celular Recolección de células de tejido primario NOTA: El proceso descrito para las células de recolección de tejido primario es específicamente aplicable a los tejidos de tumor de mama de ratón y puede no ser aplicable como es de tejidos primarios de otras fuentes. Preparar tampón de digestión por disolución de 5 mg de hialuronidasa y colagenasa 30 mg en 10 ml de medio DMEM / F12 por gramo de tejido a procesar. Filtrar esterilizar tampón de diges…

Representative Results

El protocolo que se presenta aquí se puede aplicar en general a una amplia variedad de muestras de células cultivadas y primario con sólo modificaciones menores. Dependiendo de los requisitos del experimento, se puede realizar de una manera modular cuando ciertos elementos, tales como códigos de barras o de la superficie celular de la tinción, no son necesarios. Utilizado en su totalidad este protocolo permite la preparación de la masa multiplexada citometría de muestras marcadas …

Discussion

El protocolo aquí presentado se ha empleado con éxito para el tratamiento de varias líneas cultivadas de células (H1 y H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) y muestras de tejidos primarios (médula ósea de ratón, el hígado embrionario de ratón, ratón adulto hígado, tumor de ratón). Independientemente de la fuente, cualquier tejido que puede ser disociado en las células individuales, preservando el estado celular debe ser susceptibles de análisis por citometría de masa, pero puede requerir alg…

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239