Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Mass citometria utiliza anticorpos conjugados com etiquetas de metal pesado, uma abordagem que aumentou muito o número de parâmetros e oportunidades para a análise profunda bem além do que é possível com fluxo baseado em fluorescência convencional citometria. Tal como acontece com qualquer nova tecnologia, há passos críticos que ajudam a garantir a geração confiável de dados de alta qualidade. Apresentada aqui é um protocolo optimizado que incorpora várias técnicas para o processamento de amostras de células para análise de citometria de massa. Os métodos descritos aqui vai ajudar o utilizador a evitar erros comuns e alcançar resultados consistentes, minimizando variabilidade, que pode levar a dados incorrectos. Para informar desenho experimental, a lógica subjacente a passos opcionais ou alternativos no protocolo e a sua eficácia na descoberta de novas descobertas na biologia do sistema a ser investigada é coberto. Finalmente, os dados representativo é apresentado para ilustrar os resultados esperados a partir da Presente técnicasd aqui.

Introduction

Citometria permite a medição simultânea de múltiplos alvos de anticorpos a um nel de cula ica em grandes populações de células. Em citometria de fluxo baseado em fluorescência tradicional, o número de parâmetros que podem ser quantificados é limitada pela sobreposição espectral entre o espectro de emissão de vários fluoróforos, que requer cálculos de compensação cada vez mais complexos, como o número de parâmetros aumenta. Estas limitações são abordados por massa citometria, onde anticorpos de metal-conjugado pesados ​​são detectadas e quantificadas por tempo de voo (TOF) espectrometria de massa para expandir o número de parâmetros recolhidos ao mesmo tempo e produzir um perfil de proteína de abundância alta dimensional para cada célula individual.

Uma compreensão básica do funcionamento da massa citometria instrumento é benéfico para o usuário e pode ser essencial para solução de problemas. Para uma descrição mais completa do ajuste e executando uma máquina de citometria de massa,ver o manuscrito relacionados ^1. Resumidamente, uma amostra celular é marcada com um painel de anticorpos conjugados de metal de segmentação marcadores da superfície celular, proteínas citoplasmáticas, proteínas nucleares, proteínas ligadas a cromatina ou outros epitopos de interesse (Figura 1-I). As células marcadas são carregados na máquina, quer uma de cada vez através de injecção manual ou usando um amostrador automático que amostras a partir de uma placa de 96 poços. As células carregadas foram injectados através de um nebulizador, a qual gera uma pulverização de gotículas de líquido que encapsulam as células (Figura 1ii). Esta pulverização é posicionado de modo que as células são ionizados por uma tocha de plasma de árgon. Este ionização gera uma nuvem de partículas formada por todos os átomos constituintes de cada uma das células (Figura 1iii). Como esta nuvem de partículas viaja para o detector, átomos de baixa massa atómica são separados dos iões de massa elevadas por um filtro de massa de quadrupolo. Os restantes iões de massa de alta continuar para o detector, onde o abunddade de cada isótopo é quantificado (Figura 1iv). Os dados brutos recolhidos pelo detector, são analisados ​​pelo software do instrumento de citometria de massa para identificar eventos celulares. Para cada evento celular identificado, o sinal detectado em cada canal é quantificado e guardada num ficheiro de saída um .fcs. Os canais de massa utilizados para detectar os anticorpos de metal pesado conjugados apresentam um mínimo de sobreposição espectral, que varia de 0-4%, com a maioria das contribuições abaixo de 1%. Devido a essa baixa diafonia entre canais, geralmente não é necessário para transformar os dados com uma matriz de compensação antes da análise ^2. No entanto, deve ser tomado cuidado durante a concepção do painel experimental de anticorpos para assegurar que um anticorpo com um epitopo de alta abundância não é atribuído a um canal de massa que contribui sinal a um canal atribuído a um anticorpo de baixa abundância, pois isso pode criar uma população artificialmente elevados no canal de receber a contribuição de sinal.

<p clburro = "jove_content"> A preparação exacta de amostras para análise de citometria de massa é altamente dependente dos tipos de amostras a ser recolhidos e a hipótese experimental a ser testado. Nós fornecem exemplos de dois protocolos para a colheita de diferentes tipos de células (células estaminais embrionárias humanas) e células primárias (de ratinho de tumor da mama do isolado de células epiteliais). Ao começar um estudo de citometria de massa, é aconselhável primeiro fazer uma pequena experiência piloto para garantir que todos os protocolos e anticorpos a serem utilizados estão a trabalhar bem nas mãos do investigador. Isto é especialmente essencial quando estão a ser utilizados anticorpos costume conjugados, como a reacção de redução parcial durante a conjugação anticorpo tem o potencial de alterar a afinidade do anticorpo; portanto, cada anticorpo costume precisa ser validado empiricamente para garantir a precisão dos dados. Outras considerações incluem a determinação de se os anticorpos da superfície celular para ser usado no ensaio irá reconhecer os seus epitopos após fixação ou, se need para ser aplicado às células ao vivo. Alguns fixação pode evitar coloração adequada com anticorpos de superfície celular como é conhecida para ocorrer com o péptido-MHC de coloração ^{3, 4.} Realizando a coloração de anticorpos de superfície celular em células vivas pode ser necessária para alguns anticorpos, mas este opõe-se a opção de código de barras de antes da marcação do anticorpo como a maioria dos métodos de códigos de barras são realizadas após a fixação ^5, embora o código de barras à base de anticorpo ^{6, 7} é uma excepção.

Ao determinar o número de células a ser preparados para análise, é importante saber que apenas uma fracção das células carregadas dentro da máquina será detectado e produzir dados. Esta perda é principalmente devido a ineficiências quando o nebulizador pulveriza a amostra a tocha. A perda exata cento depende da massa citometria de configuração da máquina e tipo de célula, mas pode variar de 50-85% e deve serconsiderado na concepção do experimento. Este protocolo foi optimizado para 2×10 ⁶ culas por amostra mas pode ser adaptado para o processamento de tamanhos de amostras menores ou maiores. Este protocolo pode ser utilizado com modificações mínimas para tamanhos de amostra a partir de 1 x 10 ⁶ 4 x 10 ^6, no entanto, é crítico que o tamanho da amostra ser mantidos consistentes dentro de uma experiência. As alterações no número de células pode afectar a intensidade de código de barras e anticorpo coloração e deve ser mantido aproximadamente constante entre as amostras a serem comparadas directamente.

Alguns procedimentos, tais como a rotulagem de células mortas e de marcao de ADN, deve ser levada a cabo na grande maioria, se não todos os modelos experimentais. A marcação das células mortas em experiências de análise de marcadores de superfície apenas pode ser conseguida utilizando Rh103, mas Rh103 deve ser evitado para experiências onde permeabilização é necessária, uma vez que resulta em perda de coloração. Para experiências envolvendo permeabilização, é aconselhável utilizar a cisplatina <s-se classe = "refex"> 8 e, quando possível, um anticorpo que reconhece a PARP clivada ou caspase para detectar células apoptóticas e mortas.

Amostras de código de barras pode reduzir o consumo de anticorpo, diminuir o tempo de aquisição e eliminar amostra-a-amostra variabilidade ^9. O processo de barcoding envolve a aplicação de um código específico de amostra única para todas as células, que é usado para atribuir cada célula para sua amostra de origem. Depois de código de barras das amostras podem ser reunidas antes da coloração do anticorpo, um processo que assegura que todas as amostras são igualmente coradas. Para minimizar o erro experimental, é prudente de código de barras e reunir as amostras que estão a ser comparados directamente uns com os outros. Actualmente existem vários métodos para o código de barras de amostras para análise de citometria de massa ^{5, 6, 7,} dois dos quais são aqui apresentados (ver abaixo).

Com Reagen atualmente disponívelts é possível quantificar a abundância de 38 alvos de anticorpos, identificar as células na fase S ^10, distinguir as células vivas e mortas ⁸ e medir os níveis celulares de hipoxia ¹¹ numa experiência multiplexado de múltiplas amostras. Esta capacidade de recolher os dados de uma única célula elevado de parâmetros para as populações de células grandes permite uma melhor perfis de populações de células altamente heterogéneos e já produziu um número de novos conhecimentos biológicos ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destilando os dados complexo resultante à informação interpretável tem exigido o uso de algoritmos computacionais incluindo Spanning Tree Progressão da densidade normalizados Eventos (PÁ) ¹⁷ e vişne ^18.

Este artigo apresenta uma acessíveisvisão geral de como projetar e realizar uma massa citometria de experiência e introduz análise básica de massa citometria de dados.

Protocol

Colheita 1. celular Colheita de células a partir de tecido primário NOTA: O processo descrito para a colheita de células a partir de tecido primário é especificamente aplicável ao tecido do tumor da mama do rato e podem não ser aplicáveis ​​como é para os tecidos primários a partir de outras fontes. Preparar tampão de digestão por dissolução de 5 mg de hialuronidase e colagenase de 30 mg em 10 mL de meio DMEM / F12 por grama de tecido a ser processado. Filtro…

Representative Results

O protocolo aqui apresentado pode ser amplamente aplicada a uma vasta variedade de amostras de células cultivadas e primárias, com apenas pequenas modificações. Dependendo dos requisitos de uma experiência, que pode ser realizada de uma maneira modular, quando certos elementos, tais como o código de barras ou de coloração da superfície celular, não são necessários. Utilizado na sua totalidade, este protocolo permite a preparação de massa multiplexado por citometria de amost…

Discussion

O protocolo aqui apresentado tem sido empregue com sucesso para o tratamento de várias linhas de cultura de células (H1 e H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e amostras de tecido primárias (de medula óssea de ratinho, rato fígado embrionário, rato adulto fígado, tumor de rato). Independentemente da fonte, qualquer tecido que pode ser dissociado em células individuais, preservando o estado celular devem ser passíveis de análise por citometria de massa, mas pode requerer alguma optimização prot…

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239