Flowsortering og Exome-sekventering af Reed-Sternberg-cellerne af klassisk Hodgkin-lymfom
Summary
Her beskriver vi en kombineret flowcytometrisk celle sortering og lav input, næste generations bibliotek konstruktion protokol designet til at producere højkvalitets, hel-exome data fra Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) celler af klassisk Hodgkin lymfom (CHL).
Abstract
Hodgkin Reed-Sternberg-cellerne fra klassisk Hodgkin-lymfom fordeles sparsomt inden for en baggrund af inflammatoriske lymfocytter og omfatter typisk mindre end 1% af tumormassen. Materiale afledt af bulktumor indeholder tumorindhold ved en koncentration utilstrækkelig til karakterisering. Derfor beskrives fluorescensaktiveret cellesortering ved anvendelse af otte antistoffer, såvel som side- og fremadspredning, som en metode til hurtigt at adskille og koncentrere sig med høje renheds tusinder af HRS-celler fra tumoren til efterfølgende undersøgelse. På samme tid, fordi standardprotokoller for exome-sekventering typisk kræver 100-1.000 ng input-DNA, hvilket ofte er for højt, selv med strømningssortering, giver vi også en optimeret, lavindstillet bibliotekskonstruktionsprotokol, der er i stand til at producere høj kvalitet Data fra så lidt som 10 ng input DNA. Denne kombination er i stand til at producere næste generations biblioteker, der er egnet til hybridisering af hele-eXome lokkemad eller mere fokuserede målrettede paneler, som ønsket. Eksome-sekventering af HRS-cellerne, når de sammenlignes med sunde intratumor-T- eller B-celler, kan identificere somatiske ændringer, herunder mutationer, insertioner og deletioner og kopiantalændringer. Disse resultater belyser HRS-cellernes molekylærbiologi og kan afsløre veje til målrettede lægemiddelbehandlinger.
Introduction
Fremskridt i kræft genomik som følge af næste generations sekventering har ført til betydelige gennembrud i identifikationen af terapeutiske mål og i prognostikation for mange hæmatologiske og ikke-hæmatologiske neoplasmer. Nye individualiserede behandlingsstrategier baseret på specifikke genomiske ændringer introduceres hurtigt i mange tumortyper (gennemgået i referencer 1 , 2 ). På trods af signifikante fremskridt i lymfom genomik var genomet af de neoplastiske HRS-celler i klassisk Hodgkin-lymfom (CHL) blevet undersøgt. Undersøgelserne er blevet hæmmet af knapheden af neoplastiske HRS-celler inden for et reaktivt mikromiljø, hvilket gør det vanskeligt at isolere rensede HRS-cellepopulationer 3 .
Fremgangsmåden til isolering af levedygtige HRS-celler fra primære tumorer blev udviklet af Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Metoden anvender en otte-antistof-cocktail, der består af CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 og CD64 til entydigt at identificere HRS-celler fra en CHL-tumor suspension. Er i stand til at isolere mindst 1.000 levedygtige HRS-celler fra friske eller frosne cellesuspensioner fra tumorbiopsier bestående af mindst 10 7 celler (ca. 10 mg væv). Renheden er større end 90% ved flowcytometrisk analyse og anslås at være Mindst 80% ved eksome genomisk analyse af ti på hinanden følgende tilfælde.
Vi har raffineret en flowcytometrisk celleisoleringsteknik, der har lettet processen væsentligt, hvilket muliggør hurtig isolering af tusindvis af levedygtige HRS-celler fra primære CHL-tumorer 7 . Vi har brugt teknikken til at producere, hvad der menes at være tumorens første heleksome-sekvens i primære tilfælde af Hodgkin-lymfom. Vores studier demonstrerer thE gennemførlighed af høj gennemstrømning, genomgående undersøgelser af individuelle CHL tilfælde og har allerede ført til identifikation af nye genomiske ændringer med potentialet til at forklare aspekter af CHL patogenese.
Vi udviklede yderligere en rørledning til at udnytte det ekstraherede DNA til høj genomstrømning genomiske undersøgelser. For at opnå pålidelige resultater fra så få som 1.000 sorterede HRS-celler (det mindste opnået fra sekventielle tilfælde) udviklede vi yderligere en modificeret næste generations DNA-bibliotekskonstruktion 8, der tillod os at øge adapterligeringseffektiviteten og at generere DNA-fragmentbiblioteker Uden overdreven amplifikation. Denne metode muliggør analyse af rutinemæssige kliniske prøver og påvisning af tilbagevendende mutationer og kromosomale ændringer 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering af denne teknik
Dette arbejde muliggør exome-sekventering fra prøver indeholdende mindst 10 ng DNA. I den kliniske sammenhæng udelukker denne grænse de fleste fine nål aspirationsprøver på grund af utilstrækkeligt materiale, men det indeholder passende kernebiopsier og ekskise biopsiprøver. Dette gør det muligt at erhverve data fra et større sæt af mulige prøver.
Kritis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen af denne projektmetode blev finansieret af instituttet for patologi og laboratoriemedicin i Weill Cornell Medical College. Vi anerkender det Tri-institutionelle Uddannelsesprogram i Computational Biology and Medicine til delvis finansiering. Vi vil gerne takke forskerne, der delte deres tid og viden med os, især Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Tchad Locklear; Og alle fra Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, herunder Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson og Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
