描述了用于通过液相色谱/质谱基因型河豚物种的改进的聚合酶链式反应 – 限制性片段长度多态性方法。反相硅胶整料柱被用于分离消化的扩增子。这种方法可以阐明的寡核苷酸的单同位素质量,其是用于识别基础组合物是有用的。
聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性(RFLP)通过液相色谱/电喷雾电离质谱(LC / ESI-MS)进行基因分型毒性河豚物种方法的改进版本进行说明。 DNA提取进行使用基于膜的二氧化硅DNA提取试剂盒。用不含去污剂的PCR缓冲液在PCR扩增后,限制酶加入到溶液无需纯化该反应溶液。反相硅胶整料柱和一个傅立叶变换分别采用具有修饰的Kingdon阱分析器高分辨质谱仪分离和检测。流动相由400mM的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇,15毫三乙胺(pH值7.9)和甲醇中,以0.4毫升/分钟的流速输送。循环时间为LC / ESI-MS分析是8分钟,包括柱的平衡。其同位素分布模型Ø解卷积软件F中的寡核苷酸被用于从质谱计算出相应的单一同位素质量。对于寡核苷酸(范围26-79个核苷酸)的分析,质量精度为0.62±0.74 ppm的(N = 280)和优异的准确度和精密度均持续180小时不使用锁的质量标准。
质谱(MS)是一种公认的技术用于核酸,基质辅助激光解吸/电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)快速和可靠的鉴定被用于电离1,2。在MALDI技术通常具有时间飞行(TOF)分析仪相结合;然而,MALDI-TOF MS中的应用被限制为短的寡核苷酸(〜25个核苷酸(nt)的),由于随后的碎片,加合物的形成和低电离效率1,2。与此相反,ESI是适用于较长寡核苷酸(> 100核苷酸),但多个的许多充电状态电荷的离子([M-NH〕 正 )从生物大分子同时产生,因此,分析物的质量可能会超过上光谱仪的m / z范围的限制。这需要卷积谱的解释, 即 ,一个充电状态序列转变成相应的质量通过反褶积。
在小分子的质量测量中,单一同位素质量的峰, 即的情况下,只包含各元素的最常见同位素的分子的质量是最丰富的自然观察3。随着分子量的增加,同位素分布转变到更高米/ z和单一同位素峰变得由基线噪声3-5遮蔽。一旦单一同位素峰值不再是质量大于10 kDa的3检测到,平均分子质量是用于测量,而不是单一同位素质量5。在这样的情况下,其中每个单独的峰是由1达分离同位素分布只能观察到当高分辨率质量分析仪,如TOF,一个傅里叶变换6改性的Kingdon阱分析器,或傅立叶变换离子回旋共振分析器用于分析。然而,最丰富的峰是Sometimes不与均分子量5一致。这些问题可能导致困难用于准确地确定分析物。
鉴于天然丰度稳定的同位素的变化,并在所述确定的平均分子质量的困难,单一同位素质量的测量是理想的生物分子3,4-质量表征。在实践中,一个单一同位素峰是否可以观察到与否,单一同位素质量可通过观察到的同位素分布的模式相比较,以从模型分析物4,7-10计算出的理论上的估计。拟合算法8现已并入专有软件。
在ESI-MS的上下文中,都需要一个DNA双链体,纯化和脱盐的离解为直接测量,避免电离的失败是由于离子抑制和加合物形成2,10-14。这些程序troublesome然而,完全自动化的分析系统已经开发商业上涉及聚合酶链反应(PCR),样品制备和ESI-MS用于检测病原体15-20。另一种方法是引入分离液相色谱(LC)。 LC从共存物质提供分析物的上线分离,不需要事先费力的样品制备电离21,22。然而,使用的MS-兼容的移动相的核酸分离是比诸如由于核苷酸的阴离子性质的药物,肽和蛋白质大多数其它化合物更为困难。 LC / ESI-MS的最成功的例子包括使用离子对反相液相色谱。 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的流动相(HFIP)-triethylamine(TEA) -甲醇最初由Apffel 等人提出的。用于分离和检测短寡核苷酸23。 LC / ESI-MS基因分型为differentiatio的应用病原体物种,单核苷酸多态性和短串联重复序列的n个已使用毛细管聚合物整料柱可分开较长的寡核苷酸1,21,24-33报道。
在日本和美国,严重食物中毒了应有的误认和河豚的准备不当发生,这就是尽管河豚的分布和准备是严格食品安全法规34,35控制。此外,也发生在日本36使用河豚提取物的故意杀人罪。因此,河豚物种分化是从公众健康和法医调查所需的立场。此外,由于红鳍东方鲀远比其他种类的河豚的更昂贵,还需要在食品欺诈调查的上下文中分化能力。
这里,用于确定第m的详细方法通过LC / ESI-MS使用反相硅胶整料柱和高分辨率质谱仪的PCR产物的onoisotopic质量进行说明。具体地,该方法已经开发,以允许基于使用在PCR限制性片段长度多态性(RFLP)方法37,这是用于使用MS的动物物种分化的第一个例子的有毒河豚物种分化。
以提取的DNA,用于提取从血液和组织中的DNA商品化试剂盒在根据与小的修改(蛋白酶K的量和裂解溶液的离心分离)的制造商的协议被使用。然而,任何提取试剂盒可以只要细胞DNA可以用合适的回收率和纯度用于PCR被提取使用。此方法已被使用肌肉,鳍,肝脏,卵巢和皮肤37进行测试。鱼翅是特别适合,因为大的表面积,从而能快速溶解与蛋白酶K鲜,冻,干,煮和烤河豚样品成功地测试了37中。
在PCR引物组( 见表1)被设计为河豚和放大河豚的线粒体16S核糖体RNA基因。目标DNA扩增为114-115基点(属暗纹 )和86基点(属Lagocephalus)( 表5)。为了促进法DEVELOPME核苷酸,被用于参考,而不是收集真实河豚试样具有靶序列合成的寡核苷酸。引物组可以由另一引物响应于所述目的设置来代替,然而,酶消化后DNA终长度应小于100个核苷酸中保持成功反卷积所需的质谱的质量方面。此外,当目标寡核苷酸为大于约75个核苷酸长在C-阱氮气压力应减少和质谱的质量不足以成功去卷积。这些限制可以通过仪器软件的最新发展进行控制,否则在协议中部分描述了机箱内部的C-陷阱阀门必须进行调整。至于样品制备,使用无洗涤剂的试剂为在适当的峰形,足以峰强度和稳定的保留时间31方面随后的LC至关重要。
<p c小姑娘=“jove_content”>一个PS-DVB毛细管整料柱21,24-33,一个C 18逆相粒状二氧化硅柱23,40,41和疏水相互作用色谱(HILIC)柱42已被用于LC /寡核苷酸的ESI-MS分析。其中,毛细管整料列是优于其他的分离能力方面,但是,在过去的研究中使用的毛细管整料柱在内部制成,以低流速(2微升/分钟),这需要的仪器操作致力于微型LC。为了便于操作方便,市售的柱为长的寡核苷酸在较高流速(100-400微升/分钟)分离评价。三对DNA双链体(26,37和53碱基对)的用上述柱分离,但,将C 18键合性颗粒二氧化硅柱和PS-DVB整料列的循环时间分别为65和70分钟,分别,而认为的C <sub> 18键合性二氧化硅整料柱是8分钟( 图1)。同时快速分析考虑,选择了-C 18键合性硅胶整体柱对我们而言,尽管有限的分离能力;然而,需要改善的分离时可使用的剩余的两列。从理论上讲,在单块列的情况下,不存在间隙体积,流动相将被迫流过固相的孔隙,同时保持了一致的路径长度,因此能够有效分离27。这样的过程将表现出来,尤其是在生物大分子的分析如寡核苷酸,作为大分子的慢扩散。一项所述的单块列的实用优点是该背压比粒状二氧化硅柱27的下部。尽管高流动速率(400微升/分钟)和低塔的温度(20℃),最大后推力系统为12.5兆帕37。这是相当长的寡核苷酸的快速分析为C 18键合性硅石整料列的优点的第一个示范。由于高流速,因此不需要在界面微型LC和精确对准的专用仪器。相反,加热ESI探针需要分解的DNA双链,并如后文所述帮助DNA的电离。离子对色谱法通常用于寡核苷酸的MS兼容的分离。然而,离子对试剂通常与ESI过程干扰和减小ESI-MS的灵敏度。因此,HFIP经常用于流动相,以提高寡核苷酸的灵敏度。然而,HFIP(沸点59℃)在界面迅速蒸发甲醇(沸点65℃),因此,溶剂这一损失增加的pH并促进离子对试剂的离解( 即 ,TEA)之前从寡核苷酸。因为本方法使用加热的ESI探针,其nebulizes在350℃的热氮气的洗脱物,这种影响可能被过分强调。取而代之的HFIP-TEA缓冲,ERB和Oberacher推荐cyclohexyldimethylammonium醋酸(CycHDMAA; pH值为8.4)进行基因分型分析,因为在加合物形成的减少与微量金属离子33。作者推断CycHDMAA本身抑制了金属加合物的形成。尽管文献中,显著加合物的形成还没有在本发明的方法观察到的。此外,HFIP-TEA -甲醇系统的值得注意的优点是,与HFIP-TEA -甲醇系统获得的峰面积比分析T的86 bp的扩增时从CycHDMAA -乙腈系统获得更大的17倍poecilonotus(数据未显示)。在HFIP-TEA – 甲醇系统的一个缺点,但是,是相对于CycHDMAA – 乙腈系统的成本增加。
的单一同位素质量的计算需要多电荷离子的同位素峰的分离。因此,分辨率是目前的分析至关重要。虽然所需的分辨能力取决于分析物的碱基对长度,常规的TOF分析仪,其具有数万的分辨能力,可以被限制为短寡核苷酸的分析。
在表4所示的理论单同位素质量,从该分析物的相应的碱的组合物计算的。可替代地,Muddiman 等人开发的软件应用程序以从精确质量43计算基础组合物。类似的程序集成到自动化ESI-MS系统,16-18。使用这些算法可以提高本方法的鲁棒性,因为所测量的单一同位素质量并不总是对应于一个独特的基础组合物ö翼3 ppm的从不可避免的测量误差导致的质量偏差。不幸的是,我们无法获得这些软件产品进行本研究。
因为本方法是基于分析基础组合物并没有涉及专门为河豚设计了一个程序本单同位素基于质量的物种确定可以是不仅适于河豚的分化,而且用于检测其它DNA多态性。作为用于检测的DNA多态性的,专用ESI-MS系统是完全自动化的,易于操作,其可以是适合于诊断用途,如检测的病原体15,17,18,20,30。相反地,本发明的方法是用共同的研究仪器和设备,因此,适合用于研究用途的可行性。 ESI-MS已被应用到人DNA多态性例如单核苷酸多态性13,28,32,短串联重复26和线粒体DNA analsis 16,19。微小RNA是通过毛细管LC / ESI-MS 44也进行分析。这些公布的申请也可以通过本发明的方法实现的。此外,这种方法可以适用于监测寡核苷酸和低分子量的化合物,如抗生素由于低温分离的相互作用和核糖体RNA 45之间的相互作用。在这样的情况下,寡核苷酸,低分子量的化合物,应同时检测,这是利用LC / ESI-MS的优点。
有一个限制,即该仪器不适合作为常规技术例如Sanger测序和实时PCR进行平行分析。此外,本发明方法只标识基础组合物和在同一分子内的任意碱基置换不能区分。然而,这里描述的基于MS-DNA分析还可能有长期好处与DNA结合染料基技术如凝胶电泳和实时PCR比较精确的第
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |