Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang

Summary

Un protocole d'utiliser un poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltre enduit pour la capture efficace et la libération thermosensible de cellules viables tumorales circulantes (CTC) est présenté. Cette méthode permet la capture de CTC à partir du sang des patients et la libération subséquente de CTC viable pour la culture en aval hors puce, des analyses et de caractérisation.

Abstract

Nous démontrons une méthode pour la taille de capture à base de cellules viables de la tumeur de circulation (CTC) dans le sang total, ainsi que la libération de ces cellules de la puce pour l'analyse et / ou de la culture en aval. La stratégie emploie l'utilisation d'un roman Parylène C fente de la membrane poreuse microfiltre pour capturer CTC et un revêtement de poly (N–iso propylacrylamide) (PIPAAm) pour thermosensible libération viable du CTC capturé. La capture de cellules vivantes est activé en tirant parti de la conception d'une géométrie fente de pores avec des dimensions spécifiques pour réduire la contrainte de cisaillement généralement associé au processus de filtration. Alors que le microfiltre présente une grande efficacité de capture, la libération de ces cellules est non-trivial. Typiquement, seul un faible pourcentage de cellules sont libérées lorsque des techniques telles que l'écoulement inverse ou en grattant les cellules sont utilisées. La forte adhérence de ces cellules cancéreuses epitheliales sur la membrane de parylène C est attribuable à une interaction électrostatique non spécifique. Pour contrecarrer eest l'effet, nous avons utilisé l'utilisation du revêtement PIPAAm et exploité ses propriétés interfaciales sensibles à la chaleur pour libérer les cellules du filtre. Le sang est d'abord filtrée à température ambiante. En dessous de 32 ° C, PIPAAm est hydrophile. Ensuite, le filtre est placé soit dans les milieux de culture ou un tampon maintenue à 37 ° C, ce qui se traduit par la rotation PIPAAm hydrophobe, et en libérant ensuite les cellules liées électrostatiquement.

Introduction

La maladie métastatique est responsable de la plupart des décès par cancer. Développer biomarqueur de diagnostic et de pronostic compagnon pour la métastase est crucial dans la gestion et le traitement du cancer. les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle central dans la diffusion de la tumeur et les métastases. En outre, étant facilement accessible comme une «biopsie liquide» biomarqueur, CTC chez les patients atteints d'un cancer du sang périphérique a augmenté comme un «foyer» pour la recherche sur les biomarqueurs du cancer. CTC ont été bien validé comme un biomarqueur pronostique dans divers milieux de cancer, notamment du sein, de la prostate et le cancer colorectal ^1-3. Cependant, les avancées récentes dans le domaine de la CCT a indiqué que la seule énumération de ces cellules rares a limité l' utilité clinique, comme montré dans les essais cliniques interventionnels ^4. Ainsi, il existe un besoin émergent pour les technologies qui permettent la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la CCT. Actuellement, seuls quelques technologies existent qui permettent for non-antigène polarisé, la capture viable et la libération de la CCT, ce qui permet robuste aval moléculaire et fonctionnelle analyse ^5,6. La majorité de ces dispositifs micro – usinés sont couplées aux plates – formes microfluidiques et ont donc un facteur limitant dans la quantité de sang qui peut être traitée, qui varie de 2 à 4 ml ^7-10. CTC sont des événements rares dans un seul tube de prélèvement de sang (7,5 ml), donc de réduire encore la quantité de sang qui peut être traitée, entrave considérablement les chances de capturer et isoler ces cellules d'intérêt.

Nous avons développé deux types de dispositifs Parylène C de la membrane de microfiltration pour la capture du tétrachlorure de carbone qui exploitent les différences de taille entre les plus grandes cellules tumorales et les cellules sanguines normales plus petites ^11,12. Nous avons précédemment rapporté sur le filtre poreux de dénombrement rond et comparé avec une plate – forme approuvée par la FDA, où le micro – filtre a été montré supérieur au tétrachlorure de carbone efficacité de capturepour les échantillons de sang des patients du cancer ^13,14. Cependant, une limitation du filtre ronde est la nécessité d'utiliser un fixatif à base de formaldéhyde avant la filtration. Ce processus préserve les cellules morphologie tout en leur permettant de résister à la contrainte et la pression de cisaillement pendant le processus de filtration. Alors que le dénombrement et des études moléculaires peuvent être réalisées sur la puce ^13, le fixatif altère la capacité d'effectuer la caractérisation fonctionnelle. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un filtre à pores de fente qui nie la nécessité de fixer les cellules avant filtration (Figure 1). La géométrie fente de pores (6 pm largeur x 40 um pores de fente de longueur) permet aux cellules tumorales à capturer tout obstruant partiellement un pore et donc en permettant le passage libre pour d'autres cellules sanguines et atténuer la montée en pression qui conduirait à des dommages cellulaires et une éventuelle rupture ^15,16 La fente de cartouche de pores est composé de 2 pièces qui prennent en sandwich acryliquesle filtre fente de pores entre la pièce supérieure et inférieure avec Polydiméthylsiloxane (PDMS) agissant comme un joint d' étanchéité pour fournir une fuite de joint étanche ^14,15 (figure 1).

Bien que l'efficacité de capture du filtre fente de pores est élevé, (tableau 1), le CTC capturé sont liés à la membrane de parylène C par de fortes interactions non-spécifiques électrostatiques au lieu de la matrice extracellulaire (ECM) médiée adhérence ^15. Des méthodes telles que l'écoulement inverse, ou l'utilisation de racleurs de cellules ne parviennent pas à libérer efficacement les cellules du filtre, ou entraîner des dommages aux cellules et la mort cellulaire. Nous avons exploré une utilisation non conventionnelle de PIPAAm pour formuler une stratégie de libération ^15. PIPAAm est un polymère qui est soumis à une température de solution critique inférieure (LCST) la transition de phase réversible à une température de solution de 32 ¹⁷ ° C. Traditionnellement, cette propriété de PIPAAm a été largement explorée pour les applications d'ingénierie tissulaire. Habituellement, les cellules sontles surfaces cultivées sur PIPAAm enrobé à 37 ° C lorsque PIPAAm est hydrophobe. Les cellules peuvent ensuite être détachées sous forme de feuille quand la température de la culture est déplacée au – dessous de 32 ° C, où la surface revêtue PIPAAm devient hydratée ^17,18. Nous avons exploité cette propriété thermique en effectuant le processus de filtration à la température ambiante (inférieure à 32 ° C), puis permettre la libération de cellules en plaçant le filtre dans les milieux de culture maintenue à 37 ° C. A cette température, la couche de polymère devient hydrophobe PIPAAm, libérant ainsi les cellules liées électrostatiquement ¹⁵ (figure 1).

Bien que la méthode sensible à la température, ainsi que d' autres méthodes ont été mises en œuvre avec succès pour atteindre viable capture CTC et de libérer ^{19 – 21,} une clé inconvénient potentiel partagé par ces technologies déclarées est qu'ils emploient tous un principe de l' antigène dépendant de la CCT capture. Capture d'antigène CTC sur la base, comme le montre la précédemment, peut conduire à une analyse biaisée CTC ^11,14. Par exemple, de nombreuses technologies basées sur l'affinité emploient anticorps qui se lie EpCAM pour le CTC capture. Cependant, la CCT a été montré pour exprimer différents niveaux de EpCAM, conduisant à une omission de EpCAM faible et EpCAM CTC négative par ces technologies. En outre, les limitations peuvent se produire lorsque la CCT d'origine non épithéliale est d'intérêt, tels que la CCT dans les milieux de mélanome et le sarcome. Ainsi, une technologie qui permet la capture et la libération viable CTC sans biais potentiel introduit par l'antigène à base de capture est hautement souhaitable.

Fait important, le dispositif microfiltre de capture est purement dimensionnée sur la base et la stratégie de libération est agnostique à la présence de certains marqueurs de surface. Nous croyons que l'emploi du microfiltre revêtu PIPAAm aidera à élargir notre compréhension du processus métastatique, en fournissant la capacité de capturer et libérer la CCT pour les analyses en aval efficace et efficiente. Cela peut puissanteexposer ially nouvelles molécules pour lesquelles de nouvelles thérapies ciblées systémiques pourraient être dirigés ainsi que de fournir un biomarqueur qui peut être contrôlé facilement et l'aide dans le cancer de gestion des patients.

Protocol

Déclaration éthique: Pour protéger les droits des sujets humains, des échantillons de sang ont été obtenus suite à un consentement éclairé dans les protocoles approuvés par l'Université de Miami examen institutionnel des conseils en vertu de la CISR 20150020. NOTE: Le sang à filtrer pour le CTC capture doit être recueillie dans un tube EDTA pour empêcher la coagulation. 1. Le revêtement du Microfilter avec Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Peser PIPAAm pour préparer une…

Representative Results

L'utilisation du sang de donneurs sains (obtenu en vertu d'un protocole approuvé par l'Université de Miami CISR 20.150.020 suite à un consentement éclairé) dopés avec des cellules cancéreuses en culture, la technique thermosensible pour la libération de cellules viables circulant tumorales (CTC), la capture réalisée, la libération et l'efficacité de la récupération de 94% ± 9%, 82% ± 5% et 77% ± 5% , respectivement (tableau 1) 15.</s…

Discussion

Le processus de capture CTC viable à partir du sang total et en les libérant du microfiltre est relativement simple; cependant quelques points critiques méritent d'être mentionnés. Il est impératif, comme avec toute la culture cellulaire qu'une condition stérile est maintenue grâce à l'ensemble du processus. La première étape de revêtement du filtre avec PIPAAm est critique, car la base de la technique de libérer les cellules du filtre est basée sur l'exploitation des propriétés interfaci…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice