The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Et kritisk trin i denne bakteriel konkurrence arter protokol, som adskiller den fra andre, er det natten over inkubation af inhibitoren isolere før tilsætning af konkurrent isolat. Inhibitoren stamme kræver denne vækst periode at frembringe inhibitoriske forbindelser. Som konkurrenten stamme overlejres oven på det samme medium, denne fremgangsmåde tillader forskeren at iagttage det fulde potentiale af inhibitoren stamme til at interferere med væksten af konkurrenten stamme. Som et resultat, dette assay afspejler, hvad der sker med naturen; ét isolat er fuldt etableret i en niche, og den anden skal være i stand til at modvirke eventuelle inhibitoriske variabler til at kunne slå invadere niche.
Der er to dele i denne protokol, der er mest tilbøjelige til at forårsage fejlagtige resultater, hvis udført forkert. For det første kan ufuldstændig sterilisering af fordamperen flasker indføre forurenende bakterier i assayet. INCUbation af bouillonen bruges til skylning af vaporizer flaske i trin 3.6 i en steril beholder kan anvendes til at bekræfte flasker blev fuldstændigt steriliseret. Yderligere vask i desinficerende opløsninger, såsom Virkon, kan anvendes forud for vask i overfladeaktivt rensemiddel, der er beskrevet i trin 3.2, hvis yderligere sterilisation er nødvendig.
Et andet trin, der kan forårsage fejlagtige resultater er fortyndingen af konkurrent-stammen (trin 6.1). Hvis fortyndingen ikke er optimal, klare målinger af inhibering kan ikke let bestemmes. Dette assay blev optimeret under anvendelse af forskellige nasale isolater som inhibitor-producerende stammer tværs af en bred vifte af Gram-positive og Gram-negative arter versus S. aureus SH1000 som konkurrent stammen 7,8. Det er efterfølgende blevet testet ved hjælp af forskellige koagulase-negative og koagulase-positive stafylokokker som konkurrent og inhibitor-producerende stammer. Når andre end de ovenfor beskrevne som konkurrent slægterstamme, kan en vis optimering af fortyndingen for inokulum være nødvendig.
Hvis klarhed scoringer varierer betydeligt mellem gentagelser, kan det være nødvendigt at standardisere konkurrenten stammen inokulum ved at sætte den til en bestemt optisk tæthed. Dette vil dog øge den tid, analysen tager at sætte op, og det er sandsynligt at reducere antallet af stammer er det muligt at behandle per eksperiment. Visuelt tilpasning kulturen til en passende OD under anvendelse af en McFarland standard kan tilvejebringe en hurtig alternativ.
En begrænsning ved denne teknik er, at det kun kan anvendes på dyrkbare bakterier. Derfor er mange undersøgelser bruger 16S rRNA sekventering til at forudsige konkurrencedygtige udelukkelse interaktioner 3,4,13. Dog kan genetiske og metagenomisk teknikker kun skelne medlemmer community til artsniveau, og / eller tager ikke højde for særlige intraspecifikke træk variation. Det er muligt at screene for associering af en particular gen, som koder for en egenskab med tilstedeværelsen eller fraværet af en bakterieart 5, men dette kræver forudgående kendskab til et gens sandsynligvis være forbundet med udelukkelse af en art.
En sikkerhed overvejelse af denne teknik er, at på grund af aerosoldannelse af bakterier, kan det kun anvendes i laboratorier med en niveau 2 sikkerhedsskab eller med lignende sikkerhedsforanstaltninger. Der er alternative teknikker til at teste for konkurrence mellem isolater, der tegner sig for intraspecifikke træk variation og ikke genererer aerosoler af bakterier. En sådan metode er den samtidige antagonisme Assay 2. Ved denne fremgangsmåde er et inokulum på ét isolat udspredt på en agarplade, og en anden isolat inokulum er plettet eller stukket ned oven, når den første er tørret. Dette ville producere et miljø, hvor de stammer er i direkte konkurrence (samtidig antagonisme), både konkurrerer om at producere hæmmende forbindelser og scavenge næringsstoffer først. Den advantage af den udskudte væksthæmning assay over samtidige antagonisme analysen er, at inhibitoren isolat altid skal have den konkurrencemæssige fordel af at blive etableret helt, før invasionen af konkurrenten isolat. Dette er mere reflekterende af hvad der ville ske i miljøet, som i de fleste nicher vil ét isolat blive etableret før der tilsættes anden stamme, snarere end to isolater bliver tilføjet på samme tid 8.
Et andet alternativ for at undgå aerosoldannelse af bakterier ville være at tilføje konkurrenten isolere i topagar, der kunne hældes i stedet sprøjtes over inhibitoren isolat. volumenet af topagar tilsættes, ville imidlertid nødt til at være ca. 3 ml at sikre jævn dækning af pladen. Inden for denne volumen, ville konkurrenten isolat ikke vokser på samme medier som inhibitor isolatet, så ville ikke lider reducerede næringsstoffer. Konkurrenten ville heller ikke være i direkte kontakt med eventuelle hæmmende forbindelser until de diffunderet ind i topagar. En sådan analyse kunne ikke betegnes som udskudt hæmning eller samtidig antagonisme.
En lignende fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at vurdere niveauerne af bacitracin resistens blandt klinisk S. aureus isolater 10. Den væsentligste forskel mellem den her beskrevne protokol og der er beskrevet med 10, er sidstnævnte kun klassificerede konkurrerende stammer som følsomme (komplet inhibition- klarhed score 0) eller resistente (delvise til ingen inhibition- klarhed score 1-5). Den udskudte væksthæmning assay kan derfor også anvendes til at screene for niveauer af resistens til producenter af bestemte antibiotika, eller endda at søge efter nye antimikrobielle stoffer er aktive mod multiresistente patogener.
Det er blevet foreslået, at værten mikroflora kunne manipuleres til at eliminere uønskede medlemmer af den bakterielle samfund 9. Anvendelse af corynebakterier eller Staphylococcus epidermidis har allerede vist sig at eliminere S. aureus kolonisering i næsebor i en betydelig del af befolkningen 11,12. Undersøgelser specifikke stammer som kompetitivt kan udelukke uønskede medlemmer af værten flora gennem teknikker som den her beskrevne, kan derfor føre til fremtidige lægemidler.
The authors have nothing to disclose.
JCM er finansieret af en BBSRC-IPA award med Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG er finansieret af en saudiarabisk ministerium for videregående uddannelser PhD studentship.
Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |