繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

Summary

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Abstract

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Introduction

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

Protocol

以下の方法は阻害剤産生株で競合他社の株をテストするために7,8を適合されています。 注：このプロトコルは、細菌培養でエアロゾル生成を含みます。これは、ローカルでのみ、承認された安全性を考慮の実装に含まれる空間で実行することができます。レベル2の安全キャビネット内で寒天プレート上に文化の噴霧は寒天プレートと周辺環境の汚染を最小限に抑えることができます。研究者は封じ込めレベル2の生物を使用している場合、これはまた、噴霧菌のエアロゾル吸入から研究者を保護する、これが主要な関心事です。適切な個人保護具を着用する必要があります。ペトリ皿の周囲に最良使い捨て吸収性組織で覆われています。 UV光を用いて、ポストスプレー除染をお勧めします。 1.寒天プレートの準備マヌーに応じて、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天を準備facturerの指示。 、121℃でBHI寒天培地をオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 滅菌ペトリ皿に滅菌BHI寒天15mlのアリコートを注ぎ、それを設定することができます。 注：このアッセイ内で使用するすべての寒天プレートは、寒天の同じ株に由来し、寒天の同じ量を各プレートに存在することを確認してください。これは、利用可能な栄養素と比較を可能にするプレート間の阻害剤拡散の変動を制限します。 2.無菌ブロスの準備します製造元の指示に従ったBHIブロスを準備します。 28ミリリットルのガラスユニバーサルボトルにBHIの10ミリリットルのアリコートを追加します。 、121℃でBHIブロスをオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 注：ブロスAUTの同じバッチに由来するアッセイで使用されているすべてのスープを確認してください結果の変動を引き起こす可能性の栄養素の変動を制限するために、同時にoclaved。 3.準備滅菌気化ボトル（複数可） vapourizerボトルを解体。 一晩5％の界面活性洗浄剤でvapourizerボトル、蓋とvapourizerを浸し、内部汚染物質を除去するためにvapourizerを通して5％の界面活性洗浄剤をスプレーします。 注：界面活性洗浄剤を取り扱う際には手袋と適切な個人保護具を使用する必要があります。 無菌空気流フードの下で気化器、蓋と瓶を乾燥させます。 70％エタノールでボトルを記入し、vapourizerを再接続し、vapourizerを通してエタノールの一部をスプレー。 気化器の蓋を入れて、使用するまで内部のエタノールで保管してください。 使用直前に、無菌的に滅菌BHIブロスでボトルを洗浄し、vapourizerを通して培養液をスプレー。 注：これは、エタノールAFFを防止します6.3節でボトルに加え接種材料をecting。 細菌の一晩培養物（複数可）を準備4 無菌BHI寒天プレート上にストリーク競合他社と阻害剤の株を、約18時間（一晩）好気的に37℃でインキュベートします。 注：このプレートを4℃で保存した場合、同じ週間内の複数の複製のために使用することができる細菌のストックを生成します。 28ミリリットル万能ボトル内の必要な競争相手の細菌株の単一コロニーを滅菌BHIブロスの10ミリリットルを接種します。 オービタルシェーカーで250 rpmで振とうして好気的に37℃で一晩ユニバーサルボトルをインキュベートします。 インヒビター産分離株の5スポット文化セクション4で説明したように一晩培養物（複数可）を準備します。 寒天プレートは蓋の上結露しないと、完全に乾燥していることを確認し、接種前に（PLAをインキュベートすることにより、 例えば37℃で60分間）のためのTE;これは、接種部位から板全体に広がるの接種材料を防ぐことができます。 寒天プレートの中央に一晩培養のピペットを25μl。完全に寒天を横切っ文化をスプレー気泡を防止するために、ピペットプランジャーを押し下げることは避けてください。 文化は文化の広がりを制限するために、室温で乾燥することができます。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。 6.準備テスト他社株のスプレー接種物（複数可） 約4×10 6 CFU ml -1の得るためにBHIブロス中で部4希釈で一晩培養10倍に説明したように一晩培養液を用意し、OD 600 0.3±0.05のサスペンション。 注：10倍希釈は、4×10 6 CFUミリリットルを与えることはありません-1すべての細菌種のために、1×10の間の連続希釈液をメッキ普及により、必要な希釈係数を計算します<s> -1 -1×10 -6アップ。 無菌のプラスチック製の香水の気化器ボトルに希釈した培養を注ぎます。 注：総容積は寒天プレートの数がスプレーされるために必要とされる以上でなければなりません。プレート当たり約250μlを直径9cmのシャーレに適しています。 7.繰延成長阻害アッセイ文化は前寒天上に噴霧するスプレー機構にロードされていることを保証するために、気化器ボトルの各を通じて文化をスプレーしてください。 寒天上記の15cm程度の距離から、全体の寒天表面上に希釈した培養の約250μlの（典型的な50ミリリットル気化器の3スプレー）をスプレー。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。スプレーの同じ番号を持つ他のプレートについて、この手順を繰り返します。 8.繰延成長阻害アッセイの結果の解釈噴霧competiの増殖阻害ゾーンを測定しますタ株（ 図1A – C、「X」「X」へ）（ – C、 "Y"に"Y" 図1A）阻害剤プロデューサーの中心スポットの直径を差し引いミリメートルで、。 メモ： 図1Eは、このデータを提示する方法を示してい阻害ゾーンのための透明度スコアを記録します。 注：これは、観察された阻害の程度を示します。例は、 図1Aに示されている- D、標準化のために使用することができる株は、代表的な結果のセクションで提案されています。以下の規模は、明確化のスコアリングに使用することができます：0の透明度スコアは、競合他社株の成長の完全な阻害のゾーンを記述すること。 1のスコアがクリアのゾーンに存在する唯一の個々のコロニーで、成長のほぼ完全な阻害のゾーンを説明します。 2のスコアが減少し、成長の可視ゾーンを記述するために、このゾーン内の成長は詐欺です流暢またはコンフルエントに近いが、> 50％の密度が縮小されています。 3のスコアは最小限の成長の減少を説明するために、増殖がコンフルエントと50％未満減少し、ゾーンが依然として可視で測定されます。成長の目に見える阻害を記載していないための4つのスコア。 5のスコアは、競合他社の株の増殖が試験阻害剤産生株の近くに増加したことを記述します。例については、 図1を参照してください。これらのスコアは、実験者に主観的です。 9.レプリケート得られた結果の再現性を決定するために、生物学的三重に少なくともアッセイを繰り返します。 注：複製を別の日に行っている場合は、測定を行い、4℃で、その後、インキュベーションから取り出した直後のいずれかのストアプレートをプレートスコアまたはそれらを廃棄する前に、プレートの高品質の写真を撮ります。ストレージまたはプレートの写真は別の日の間の結果の比較が容易に可能になり、トン彼は日/実験全体で再現性の得点を確認するために特に重要です。プレートのストレージが結果を変える可能性を持っていることに注意してください。 注：明確な写真の場所プレートのために直立拡散光の領域でつや消し黒の背景にその蓋なしでは、レンズ（マクロモード）に近いオブジェクトに焦点を合わせることのできる高解像度カメラ（≥8MP）を使用します。また、白色光に設定し、トランスイルミネーターといくつかのゲルイメージャは、高品質、再現性の高い画像を生成することができます。

Representative Results

アッセイの結果は、中央にスポット阻害剤産生株（ 図1）の近くにオーバーレイされた競合他社の株の違いとして観察可能でなければなりません。これらの違いは、完全な阻害（ 図1A）、部分的な阻害（ 図1Bおよび1C）、無阻害（ 図1D）または正の関連性として解釈することができます。広く利用可能なラボは、S菌株表皮 Tü3298とS.表皮 Rp62A、およびS.表皮 Rp62AとS.黄色ブドウ球菌 Newmanのは、それぞれ図1Bおよび1Dに使用しました。我々は、これらの株は、このプロトコルを試験するために使用され得ることを示唆しています。 テストした種に応じて、完全な阻害と部分的な阻害は、最も可能性の高い抗菌ペプチド、抗生物質または他の拡散性の成長inhibitoの結果であります阻害剤産生株によって産生されるrsの。部分的な阻害はまた、阻害剤株6によって競合他社の取り込みに起因する歪みや栄養素の封鎖のための減少栄養利用にリンクされています。 同じ競合他社株に対して試験した異なる阻害剤を産生する分離株の間で阻止帯の大きさの比較は、次のいずれかの違いを示しています阻害剤生産菌によって産生される抗菌剤の量;メディアを通じて拡散する阻害剤の能力;阻害剤の種類が生成され、生成される阻害剤の競合株の抵抗レベル。同じ阻害剤産生株に対してテスト異なる競合他社の株の間で阻止帯の大きさを比較すると、生成される阻害剤に競合他社株の抵抗レベルの指標です。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページ= "1">結果は、使用抑制株及び使用競合他社株によって異なります。同じ抑制および競合株を用いて繰り返しは、理想的には、（セクション8.2で説明）と同じ透明度スコアを持っている必要があり、これは良い技術が全体を通して使用されたことを示します。 細菌の一貫性のないアプリケーションが発生した場合のプレートを使用するべきではありません。例えば、テスト競合文化はあまりにも阻害ゾーンは、典型的には、（ 図2A）が観察されたよりも大きく、あまり明確に定義されたエッジに表示されます希薄である場合、これは、任意の比較ゾーンの測定値の信頼性に影響を与えるだろう。阻害剤産生株のスポットが完全に一晩のインキュベーションの前に乾燥されなかった場合、阻害剤の株は、典型的には、ゾーンの測定に影響を与えるだけでなく、透明度スコアに影響を与える可能性が明確に定義されたスポット（ 図2B）を形成広がっていない可能性があります。競合株である場合均等に噴霧していない、これは、細菌（ 図2C）の不均一広がりにつながることができます。競合他社株があ ​​まりにも集中している場合、それは競合他社の株が阻害剤株（ 図2C）の上に成長する可能性があり、極端な場合には、これは競合他社/インヒビター株の役割のいくつかの反転につながることができます。 図1： 繰延増殖阻害アッセイから得られる定性的および定量的な結果の範囲増殖阻害についての結果は、（B）部分阻害（スコア1）、（A）完全な阻害（0のスコア）の範囲とすることができます、（C）部分阻害（2のスコア）（D）阻害なし（4のスコア）へ。ラベルは（Y）阻害剤の株の増殖のエッジと抑制の最も外側のエッジを示していますゾーン（X）。 A、B、CおよびDの結果は、最近のブドウ球菌の分離株について示されているで撮影プレートのための測定値を示す（E）に示すように0 mmのから10mm以上の阻害帯のゾーンのサイズ、（ 、C）または共通ラボブドウ球菌は、Sを分離します表皮 Tü3298（阻害剤）とS.表皮 Rp62A（競争相手）（B）、及びS.表皮 Rp62A（阻害剤）とS.球菌ニューマン（競技者）（D）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2： 貧しい技術による矛盾した結果の例 （た場合の結果は予想よりも異なる場合があります</stro競合他社株が均一に散布していなかった、あまりにも濃縮した場合はNG>）競技株があ ​​まりにも希薄た、（B）阻害剤の株は、インキュベーション/プレートの前に完全に乾燥しませんでしたが、乾燥または（C）はありませんでした。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。

Discussion

他人からそれを区別し、この細菌種の競争プロトコルの重要なステップで、阻害剤の一晩のインキュベーションは、競合他社の単離物の添加前に隔離される。阻害剤の株は、阻害化合物を生成するために、この成長期間を必要とします。競合株を同一培地の上にオーバーレイされているように、この方法は完全な可能性を観察するための研究を可能にします 競合他社の株の増殖を妨害する阻害剤株の。その結果、このアッセイは、自然と何が起こるかを反映しています。 1分離株は完全にニッチに設立され、他方が正常にニッチに侵入することができるように、任意の阻害変数に対抗することができなければなりません。

誤って行うと、誤った結果を引き起こす可能性が最も高いこのプロトコルには2つの部分があります。まず、気化器ボトルの不完全な滅菌は、アッセイに細菌の混入導入することができます。 Incu滅菌容器に、ステップ3.6において気化ボトルを洗浄するために使用される培養液のbationを完全に滅菌したボトルを確認するために使用することができます。追加の殺菌が必要な場合などVirkonなどの消毒剤溶液中での追加の洗浄は、ステップ3.2で説明した界面活性洗浄剤で前洗浄に使用することができます。

誤った結果を引き起こす可能性がある第二段階は、競合他社株（ステップ6.1）の希釈です。希釈が最適でない場合には、阻害の明確な測定が容易に決定されなくてもよいです。このアッセイは、阻害剤を産生するS.対グラム陽性およびグラム陰性種の幅広い株をなど、様々な鼻の分離株を用いて最適化しました競合他社株^7,8として黄色ブドウ球菌 SH1000。続いて、それを競合他社と阻害剤生産菌として様々なコアグラーゼ陰性とコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を使用してテストされています。競争相手として上述したもの以外の属のテスト時株は、接種物のための希釈のいくつかの最適化が必要になることがあります。

透明度スコアは繰り返しの間で大幅に変化した場合、特定の光学密度に設定することで、競合他社株接種物を標準化する必要があるかもしれません。しかし、これは、アッセイがセットアップにかかり、実験ごとに処理することができる株の数を削減する可能性がある時間が長くなります。視覚的に迅速な代替手段を提供することができるマクファーランド標準を使用して、適切なODに培養物を調整します。

この手法の1つの制限は、それが唯一の培養可能細菌に適用することが可能です。多くの研究は競争的排除の相互作用^3,4,13を予測するために、16S rRNAの塩基配列決定を使用する理由です。しかし、遺伝的およびメタゲノム技術が唯一の種レベルにコミュニティのメンバーを区別することができ、および/または特定の種内の形質変化を考慮していません。 particulの関連性についてスクリーニングすることが可能です細菌種⁵の有無に形質をコードするAR遺伝子が、しかし、この種の排除と関連する可能性が高い遺伝子の事前知識を必要とします。

この技術の安全性の考慮事項は、細菌のエアロゾル生成のために、それが唯一のレベル2の安全キャビネットに研究室で使用される、または類似の安全上の注意事項を説明することができ、ということです。種内特性ばらつきを考慮し、菌のエアロゾルを発生させない分離株との間の競合をテストするための代替技術があります。そのような方法の一つは、同時拮抗アッセイ²です。この方法では、1分離株の接種材料を寒天プレート上に広げられ、最初は乾燥させた後に第二の分離株の接種材料は、上部にスポットまたは刺されています。これは、両方の阻害化合物を生成し、最初の栄養素​​を捕捉するために競合する、株は直接競合（同時拮抗作用）にある環境を生成することになります。 advantag同時拮抗アッセイを超える繰延増殖阻害アッセイのeは阻害剤の分離株は、常に完全に競合分離株の侵攻前に確立されているの競争上の優位性を持っているべきであるということです。これは、別の歪みが追加される前に、ほとんどのニッチでは、1分離株ではなく、2つの単離は、同時に⁸で追加されているよりも、確立されるように、環境に何が起こるかをより反映しています。

細菌のエアロゾル発生を回避するための別の方法として、注ぎよりもむしろ阻害剤の単離物の上に噴霧することができたトップアガー、に分離する競技者を追加することです。しかし、追加されたトップ寒天の量は、プレートの偶数カバレッジを確保するために、約3 mlであることが必要であろう。このボリューム内では、競合他社の分離株は、阻害剤の分離株と同じメディア上に成長されることはないので、縮小栄養素苦しむないだろう。競技者はまた、UNT任意の阻害化合物と直接接触しないであろう彼らはトップアガー中に拡散IL。このようなアッセイは、繰延阻害または同時拮抗作用として記述することができませんでした。

同様の方法は、以前の臨床S.間バシトラシン耐性のレベルを評価するために使用されています黄色ブドウ球菌は ^10を分離^します。プロトコル間の主な違いは、ここで説明し、それが¹⁰で説明した、などの機密（スコア0 inhibition-明瞭さを完了）または耐性後者のみ分類された競合他社の株（無inhibition-明快に部分的には1-5のスコア）です。繰延成長阻害アッセイは、したがって、特定の抗菌剤の生産に対する耐性のレベルをスクリーニングするために使用することができ、あるいは多剤耐性病原体に対して活性な新規な抗菌剤を検索します。

ホスト微生物叢が細菌コミュニティ⁹の望ましくないメンバーを排除するように操作され得ることが示唆されています。コリネバクテリウムまたは黄色ブドウ球菌の応用ylococcus表皮すでにS.を排除することが示されています人口^11,12のかなりの割合で鼻孔内球菌のコロニー形成。競争的にホスト内細菌叢の望ましくないメンバーを除外することができ、特定の株への研究は、そのようなここで説明したものなどの技術を介して、したがって、将来の治療法につながる可能性があります。

Materials

Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
plastic perfume vaporizer	not known	–	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent