Introduction
Tuberkulose (TB) er en af de førende smitsomme sygdomme, der forårsager mere associerede dødsfald end HIV i verden og kombineret med stigende forøgelse af multilægemiddelresistente resistente stammer gør TB en alarmerende globalt sundhedsproblem 1. Nye diagnostiske værktøjer, mere effektive og mindre giftige stoffer og nye sikre og effektive TB-vacciner er et presserende behov for, især i udviklingslandene.
Lev svækket Bacille Calmette-Guerin (BCG) er i øjeblikket den eneste licenserede vaccine mod tuberkulose, som er blevet administreret intradermalt ved fødslen siden 1970'erne i hele verden. BCG anses effektive i forebyggelsen af alvorlige former af sygdommen (meningitis og miliær TB) hos børn, men har vist inkonsistent effekt mod lunge-TB ansvarlig for overførsel af sygdomme 2.
Pulmonal vaccination, som efterligner naturlige rute TB-infektion, repræsenterer en attraktiv tilgang til priming lokal vært immunreaktions. I denne henseende har forskellige prækliniske værker i forskellige relevante TB dyremodeller demonstreret større vaccineeffektivitet efter pulmonal immunisering sammenlignet med subkutan eller intradermal vej 3-6. Ikke desto mindre er de beskyttende mekanismer udløst af pulmonal vaccination ikke godt forstået. I de sidste år har flere værker rettet mod IL17-medieret respons som en vigtig faktor for TB-specifikke slimhinde immunrespons, som i musemodeller mangelfuld for IL17 slimhinder vaccinefremkaldt beskyttende effekt forringes 7,8.
For nylig viste vi for første gang, at intranasal BCG administration beskyttet DBA / 2-mus, en mus stamme præget af manglende beskyttelse efter subkutan BCG immunisering 9. Disse resultater antydede, at respiratorisk TB vaccination kunne være mere effektiv til at reducere antallet af TB i endemiske lande, hvor intradermal BCG anses ineffektive mod pulmonAry TB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev holdt under kontrollerede forhold og observeret for eventuelle tegn på sygdom. Eksperimentelt arbejde blev gennemført i overensstemmelse med europæiske og nationale direktiver for beskyttelse af forsøgsdyr og med godkendelse fra de kompetente lokale etiske råd.
1. Forberedelse af kvantificerede Glycerol Lagre af BCG dansk og Mycobacterium tuberculosis H37Rv
BEMÆRK: Alle de beskrevne protokoller blev udført under BSL3 betingelser.
- Optø frosne glycerol lagre af BCG dansk eller H37Rv stammer og pode 100 pi i 10 ml 7H9 medium 10 suppleret med Tween-80 0.05% (v / v) og ADC (Albumin, Dextrose, Catalase) 10% (v / v).
- Inkuber under statiske forhold i en uge ved 37 ° C, indtil kulturen er i log-vækstfase.
- Opskalering bakteriekultur ved at overføre den 10-ml kultur til 200 ml frisk medium. Der inkuberes i 20 ekstradage under statiske forhold.
- Overførsel til 50 ml centrifugerør og centrifugeres i 15 minutter ved 2500 x g.
- Kassér supernatanter og resuspender bakteriel pellet i det resterende volumen. Tilføj til hvert rør sterile 3 mm diameter glasperler (10 - 15 pr rør).
- Vortex kraftigt i løbet af 1 min for at adskille bakterielle klumper. Resuspender hver pellet i 10 ml PBS med Tween-80 0.05% (v / v).
- Lad rør i 10 min giver de største bakterielle aggregater og glasperler at slå sig ned.
- Recover 9,5 ml supernatant fra hver af de 4 rør indeholdende små klumper og enkelte bakterier og overføre mængder til en enkelt frisk 50 ml centrifugerør (endelig opsamlede rumfang 38 ml). Centrifuger i 10 minutter ved 400 x g.
- Recover 35 ml af supernatanten (indeholdende hovedsagelig enlige bakterier) i en enkelt frisk 50-ml centrifugerør, og der tilsættes 15 ml PBS med glycerol 50% (v / v), opnåelse af en endelig glycerolkoncentration på 15% (v / v).
- Bland forsigtigtog distribuere i 1-ml prøver i passende rør til frysning. Opbevares ved -80 ° C (en masse giver ca. 50 portioner glycerol lager).
- For at kvantificere glycerolstamopløsninger, optø en glycerol dagen efter nedfrysning og udfør syv ti-fold seriefortyndinger i separate 1,5 ml rør indeholdende 900 pi PBS.
- Plade 100 pi af hver fortynding i 7H10 faststof-agarmedium 10 suppleret med ADC 10% (v / v) fremstillet i 55 mm petriskåle med en diameter.
- Derefter tilsættes forsigtigt 3 mm diameter glasperler (cirka. 10 pr plade) og ryst forsigtigt pladen til lige distribuere volumen over agarplade. Kassér perler og forsegle agarplade med parafilm.
- Inkuber i 21 dage ved 37 ° C og bestemme bakteriel koncentration ved at tælle kolonidannende enheder (CFU) i de fortyndinger, hvor enkelte kolonier kan være nøjagtigt skelnes.
2. Mus Vaccination
- Optø en pre-kvantificeret BCG glycerol og fortynde det i PBS til preper to suspensioner. Beregn slutvolumen overvejer dosis pr dyret er 100 pi til subkutan administration (10 7 CFU pr ml til subkutan vaccination) og 40 pi til intranasal administration (2,5 x 10 7 CFU til intranasal vaccination).
- Brug en specialiseret anæstesi arbejdsstation til gnavere til at bedøve mus med en blanding af isofluran og ilt. Brug isofluran 5% for at inducere anæstesi og 2% for at opretholde musene i anæstesi kammer. (Kan bruges andre accepterede anæstesi metode).
- Til subkutan administration af vaccine fylde en 1 ml sprøjte med en 26 G nål med 1 ml bakteriesuspension (10 7 CFU / ml). Fjern luftbobler.
- Placer en bedøvet mus på en flad overflade i liggende stilling inde i et laminar flow hætte og inokulering subkutant 100 pi (10 6 CFU / dosis) vaccine i en flanke af musen tilbage. Retur musen til buret og overvåge det at sikre, at det properly genopretter fra anæstesi.
- Skift sprøjtenålen mellem hver mus administration. Fjernet luftbobler som beskrevet ovenfor.
- Til intranasal administration, placere en bedøvet mus i liggende stilling inde i hætten.
- Med en mikropipette tage 20 pi af suspensionen med 2,5 x 10 7 CFU / ml. Placer inokulum drop-by-slip mellem de to næsebor indtil hele volumen er deponeret, efterlader tid mellem dråber at lade musen indånder lydstyrken. Bemærk: mus kan lide af åndedrætsbesvær under denne procedure, så de bør overlades til assimilere hvert fald før administrere den næste for at forhindre det så meget som muligt.
- Re-fill mikropipetten med en anden 20 pi og gentag operationen. Hvis musen begynder at vågne op fra bedøvelsen efter den første inokulering, placere den i anæstesi kammer før den anden. Retur musen til buret og sikre, at det ordentligt genvinderfra bedøvelsen.
3. Mouse Intranasal Challenge med H37Rv Strain
- Optø en pre-kvantificeret H37Rv glycerol og fortynde det i PBS til at udarbejde en bakteriel suspension af 2500 CFU pr ml. Beregn slutvolumen overvejer dosis pr dyr er 40 pi.
- H37Rv inokuleres intranasalt som beskrevet i punkt 2.5 - 2.7. Sidste udfordring dosis pr mus er 10 2 CFU / 40 pi.
4. Analyse af induceret immunrespons i Lunger
- Lunge cellulære suspension
BEMÆRK: Vurdering af vaccine-inducerede adaptive immunrespons i lungerne kræver genereringen af enkelt cellesuspension. Til dette formål anvender vi et væv dissociator såsom GentleMACS.- Sacrifice musen ved cervikal dislokation (eller andet accepteret human metode), og sikre musen er død røre øjeæblet for at bekræfte fraværende af blink refleks.
- Inde i en laminær strømning, udtrække lungs med sterile sakse og tænger og placere dem på en ren overflade. Rene lunger fjerne luftrøret og bindevæv, og overføre lungerne til et 1,5-ml rør med PBS (vedligeholde på is indtil forarbejdning).
- For at generere et cellulært suspension, placere lungerne i en ordentlig rør for orgel dissociation (C-dissociator rør) indeholdende 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2 og 1,8 mM CaCl2 buffer.
- Tilsæt 100 pi collagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml slutkoncentration), og 40 pi DNase I 20.000 IU / ml (160 IU / ml slutkoncentration.
BEMÆRK: Stamopløsninger af collagenase D eller DNasel, fremstilles opløse lyofiliserede enzymer i PBS eller glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCI pH 7,5 y MgCI2 1 mM. - Glasset anbringes i vævet dissociator og bruge foruddefinerede program m_lung_01 for lunge fragmentering. Inkubér røret ved 37 ° C i et vandbad i 30 min.
- Place the rør i dissociator og bruge foruddefinerede program m_lung_02 for komplet lunge homogenisering i enkelt cellulære suspension.
- Passere den cellulære suspension gennem en 70-um nylon cellefilter monteret på et 50 ml centrifugerør. Vask sien med 10 ml RPMI 1640 medium.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 400 x g og kassere supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml erytrocytter lyserende puffer, der vortexes og inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 10 ml RPMI 1640 medium og centrifuger celler i 5 minutter ved 400 x g.
- Resuspender celler i 0,5 ml komplet RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml streptomycin, 100 IU / ml penicillin og 50 pM 2-mercaptoethanol.
BEMÆRK: FCS inaktiveres ved inkubering ved 56 ° C i 30 minutter. - Tæl celler og tilføj komplet RPMI 1640 medium at nå til endelig cellulær densitet på 10 7 celler / ml.
BEMÆRK: celletal, bruger vi den automatiske celletæller. - Distribuere 100 pi cellulær suspension i U-bund 96 brønd steril plade (10 6 celler / brønd).
- Der tilsættes 50 gl / brønd af komplet RPMI 1640 medium med 15 ug / ml kommerciel H37Rv Oprenset proteinderivat (PPD) (5 ug / ml slutkoncentration).
- Supernatanten indsamling til cytokin bestemmelse ved ELISA
- Inkuber pladen fra 4.1.14 i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Centrifuge plade i 5 minutter ved 400 xg og inddrive 100 pi supernatant.
- Opbevar ved -80 ° C.
- Fortynd supernatanter 1/10 og 1/2 i assaypuffer for IFNy og IL17A bestemmelse hhv. Bestem cytokinkoncentrationer med kommercielle ELISA kits, i overensstemmelse med producentens instruktioner (ELISA Development sæt).
- Intracellulær farvning til bestemmelse af cytokinproducerende CD4 + -celler ved flowcytometri
- Inkuber pladen fra 4.1.14 i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tilføj 1,5 pi Brefeldin A 1 mg / ml (lager opløst i DMSO) til hver brønd (10 ug / ml endelig koncentration) og inkuberes i yderligere seks timer.
- Centrifugeres pladen fra 4.3.2 i 1 min ved 3200 x g og kassér supernatanten.
- Resuspender celler i 50 pi anti-muse CD4-FITC fortyndet i RPMI 1640 med 10% FCS (1/500) og inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C.
- Centrifugeres pladen fra 4.3.4 i 1 min ved 3.200 x g, kasseres supernatanten, og der tilsættes 100 gl / brønd af fiksering opløsning. Der inkuberes ved 4 ° C i 20 min.
- Vask cellerne to gange med 150 pl / vask af permeabilisering opløsning.
BEMÆRK: 10x koncentreret stamopløsning fortyndes i demineraliseret vand til fremstilling 1x arbejde opløsning. - Resuspender celler i 50 pi anti muse IFNy-APC og anti-muse IL17A-APC.Cy7 fortyndet i permeabilization opløsning (1/250 begge antistoffer).
- Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask cellerne to gange med 150 pl / vask af permeabilisering opløsning.
- Resuspender celler i 200 pi PBS i flowcytometri erhvervelse.
5. Analyse af immunoglobuliner i bronchoalveolær lavage (BAL)
- Opnåelse af BAL-prøver
- Sacrifice musen ved cervikal dislokation (eller andet accepteret human metode), og sikre musen er død røre øjeæblet for at bekræfte fraværende af blink refleks.
- Expose luftrøret hjælp ordentlig præcision steril pincet og sakse og udfører et lille snit i luftrøret, og sørg for ikke at udskære det helt. Pas på ikke at forårsage blødning, som kan forurene BAL prøve.
- Indfører i luftrøret en kanyle forbundet med en steril 1 ml sprøjte med 800 pi iskold PBS.
- Podes langsomt PBS i lungerne og derefter recover BAL volumen trækker tilbage sprøjtens stempel meget langsomt for at undgå lunge sammenbrud.
BEMÆRK: Inddrivelse af 500 til 600 pi er tilfredsstillende. - Overfør BAL volumen i et 1,5-ml rør og bekræft BAL forbliver ufarvede, hvilket indikerer, at der ikke er forurenet med blod (vedligeholde på is indtil forarbejdning).
- Centrifuge BAL-prøver i 5 minutter ved 400 xg, og overførsel supernatant til et nyt rør.
- Opbevar supernatanter ved -80 ° C.
- Bestemmelse af IgA i BAL supernatanterne
BEMÆRK: Alle reagenser er ved stuetemperatur.- Coat høj proteinbinding polystyren fladbundede plader med 96 brønde med 100 pi PPD fortyndet i PBS (10 ug / ml) i M. tuberkulose-specifikt IgA bestemmelse, eller med 100 pi BAL supernatant fortyndet 10 gange i PBS til total IgA bestemmelse.
- Inkuber natten over ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten og tryk på pladen på et stykke køkkenrulle til dry. Vask med 200 pl / brønd PBS.
- Bloker med 200 pl / brønd af et bovint serumalbumin (BSA) 1% (vægt / volumen) i PBS-Tween-80 0.05% (v / v) (blokerende buffer).
- Inkuber 1 time ved stuetemperatur.
- Der vaskes én gang med 200 ul / brønd PBS-Tween-80 0.05% (v / v) (Vaskebuffer).
- Tilsæt 100 pi ufortyndet BAL supernatant i PPD-coatede brønde. Der inkuberes i to timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvis den samlede IgA beslutsomhed sker parallelt med PPD-specifikke IgA, forlade alt IgA brønde med 100 pi vaskebuffer under denne inkubering. - Der vaskes tre gange med 200 gl / brønd af vask buffer.0170004
- Tilsæt 100 pi peberrodperoxidase (HRP) -konjugeret anti-muse IgA fortyndet med blokerende buffer (1 / 10.000).
- Inkuber 1 time RT.
- Vask fem gange med 200 pl / brønd af vaskepuffer.
- Der tilsættes 100 gl / brønd af 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB). Inkuber 20 min ved stuetemperatur i than mørkt.
- Der tilsættes 100 pl / brønd af H 2 SO 4 0,5N. Aflæs pladen i et spektrofotometer ved en bølgelængde på 450 nm.
6. Bakteriel belastning beslutsomhed i lungerne
- Lung homogenisering og plettering
- Fire uger efter udfordring, ofrer musen ved cervikal dislokation (eller andet accepteret human metode), og sikre musen er død røre øjeæblet for at bekræfte fraværende af blink refleks.
- Placer musen i liggende stilling et fast og desinficeres overflade inde i en laminar flow hætte.
- Lave et snit og fjern skindet fra brystregionen at efterlade synlige den thorakale område.
- Klip ribbenene og høste lunger og hjerte ved hjælp af steril saks og pincet. Placer organer på en ren overflade.
- Rens lunger ved at fjerne hjerte, luftrør og bindevæv og overføre lungerne til et 1,5-ml rør med 1 ml deioniseret vand(Opretholde på is, indtil behandling).
- Brug sterile pincetter til at overføre lungerne af hver mus i en ordentlig rør for orgel homogenisering (M - dissociator rør) indeholdende 1 ml deioniseret vand.
- Glasset anbringes i vævet dissociator og bruge foruddefinerede program RNA_1 at homogenisere lungerne.
- Gør fem ti-fold seriefortyndinger i 1,5 ml rør, startende med 100 pi lungehomogenat fortyndet i 900 pi.
- Plate fortyndinger som beskrevet i 1,11-1,14.
- Differentiering mellem BCG og H37Rv ved PCR
BEMÆRK: I pladerne fra 6.1.6 svarer til den gruppe vaccineret med BCG ved intranasal rute, vi analyserede et repræsentativt antal kolonier af en kræsne PCR mellem BCG og H37Rv at sikre, at CFU anses for at vurdere vaccine-tillagt beskyttende effekt svarede entydigt til H37Rv. Dette PCR-mål-amplifikation af RD9, et genomisk region anderledes i BCG og M. tukulose, hvilket giver et fragment på 2618 bp for H37Rv, og 465 bp for BCG 11.- Forbered en master mix lager for alle prøver med volumen per prøve som angivet, og derefter distribuere i PCR-rør (9 pl / prøve).
BEMÆRK: Buffer 5x: 2 pi. Forward primer 25 um (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 pi, revers primer 25 pM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 pi Taq polymerase 5 enheder / pl: 0,04 pi, Deioniseret H2O: 6.32 pi. - Tryk på en koloni med en steril tandstik og fordybe tandstikker med prøven i et PCR-rør, der indeholder master mix.
- Kør PCR med følgende program: 10 min 95 ° C (dette trin er at udløse bakteriel forstyrrelser), 10 min 95 ° C (dette trin er at udløse bakteriel forstyrrelser), 35 cykler (30 sekunder ved 95 ° C, 1 min ved 58 ° C og 4 minutter ved 72 ° C).
- Indlæse PCR prøver i en 1% agarosegel med ethidiumbromid og køre prøver at visualisere fragmenterne.
- Forbered en master mix lager for alle prøver med volumen per prøve som angivet, og derefter distribuere i PCR-rør (9 pl / prøve).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbejde beskriver sammenligning af to administrationsveje af BCG: subkutan og intranasal. Subkutant er sammenlignelig med den intradermale, som er den nuværende kliniske rute for BCG verdensplan. Intranasale vej af vaccination er at efterligne den naturlige infektionsvej for M. tuberkulose, med det formål at fremkalde immunrespons direkte i lungerne, det primære målorgan for dette patogen.
Figur 1 beskriver arbejdsgangen fulgt. Otte til ti uger gamle DBA / 2 mus vaccineret med 10 6 CFU BCG dansk ved subkutan eller intranasal administrationsvej. Otte uger senere, er en gruppe mus ofret at analysere lunge immunrespons fremkaldt af vaccination. BAL-prøver først opnået, og derefter vi høster lunger. For at studere vaccine-tillagt beskyttende effekt, vi inokulere en Forskelnt gruppe mus med en lav dosis intranasal udfordring M. tuberculosis H37Rv-stamme. En måned senere, vi ofrer dyr og høst lunger. I dette tilfælde, for hvert dyr bruger vi venstre lunge til at bestemme bakteriel belastning og højre lunge til at vurdere vaccinefremkaldt immunrespons efter udfordring. Formålet er at generere bakteriel belastning og immune svardata i lungerne for hvert dyr for at undersøge potentielle korrelater for beskyttelse.
Som vist i figur 2, blev lunger dissocieret at opnå enten et organ homogenat eller en cellulær suspension. Homogeniserede lunger blev udpladet på fast agarmedium for at bestemme bakteriel belastning fire uger efter udfordring. Cellular suspension for at studere vaccinefremkaldt immunrespons blev opnået efter lunge enzymatisk behandling med collagenase D og DNasel.
Vores resultater viser tydeligt, at, når man sammenligner to subkutan vej, den intranasale rute for vaccination giver en meget større beskyttende effekt i lungerne fire uger efter challenge (figur 3A). Desuden har vi bekræftet, at bakterier i lunger fra intranasal BCG-vaccine gruppe svarer til H37Rv og ikke til BCG-vaccine. Til dette formål har vi analyseret et repræsentativt antal kolonier fra denne gruppe ved specifik PCR for RD9 genom-regionen, som forstærker forskellige længde fragmenter i BCG og M. tuberkulose (figur 3B). Figur viste klart, at alle kolonierne analyserede billede et fragment på 0,4 kbp, hvilket svarede til H37Rv.
Vore data viser sammenhæng mellem beskyttende effekt tillagt ved intranasal BCG vaccination og vaccine-induceret immunrespons i lungerne før udfordre. Intranasal BCG tydeligt udløst højere IL17 og IFNy produktion i lungerne, målt ved ELISA (figur4A). Disse data blev bekræftet ved intracellulær farvning (ICS) og flowcytometri (data ikke vist). Derudover fandt vi også en højere koncentration af både total og PPD-specifik koncentration IgA i BAL-prøver (figur 4B), hvilket indikerer, at pulmonal BCG-vaccination inducerer produktion af IgA og translokation til luftvejene.
Endelig har vi undersøgt immunrespons i lungerne efter challenge BCG-induceret (figur 5). Vores data viste forskelle mellem IL17 og IFNy; IL17A-producerende CD4 + celler blev kun fundet i intranasal BCG-gruppen, mens IFNy-producerende celler blev fundet i alle grupper inficeret med H37Rv uanset vaccination. Repræsentation af data fra hvert dyr svarende til IL17-producerende celler og bakteriel belastning viste en signifikant korrelation mellem tilstedeværelsen af IL17 og lunge bakteriel lastreduktion, som ikke blev observeret i tilfældet med IFNy.
Figur 1. Arbejdsgang for at sammenligne Intranasal og subkutan BCG vaccination. Otte uger efter BCG immunisering, et sæt mus (6 pr forsøgsgruppe) bruges til at høste lungerne og udføre en BAL, og analysere pulmonal immunrespons fremkaldt af vaccination. Et andet sæt mus (6 / gruppe), inokuleres med en lav dosis intranasal udfordring M. tuberculosis H37Rv-stamme (100 CFU). En måned senere aflives dyrene og bakteriel belastning analyseres i venstre lunge og PPD-specifikt immunrespons i højre lunge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. beskyttende effekt tillagt ved BCG immunisering. Grupper på 6 DBA / 2 mus blev vaccineret ved subkutan (BCG sc), intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaccinerede (Unvacc) med BCG Dansk vaccine 10 6 CFU. Til to måneder efter vaccination blev mus inokuleret intranasalt med en lav dosis (100CFU) H37Rv udfordring, og en måned senere bakteriel byrde i lungerne blev bestemt. Et repræsentativt eksperiment af to uafhængige vises. (A) Oplysninger i graferne er repræsenteret som middelværdi + SD. Envejs ANOVA-test med Bonferroni post-analyse blev udført for at beregne statistisk signifikans. (B) Et repræsentativt antal enkelte kolonier fra BCG intranasale gruppe blev analyseret ved PCR specifik for RD9 region (forskellig i BCG og H37Rv genomer) at skelne BCG og H37Rv kolonier. (Tidligere offentliggjort 9). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Vaccine-specifikke Pulmonal immunreaktion Analyseret Før Challenge med H37Rv. Grupper på 6 DBA / 2 musvaccineret ved subkutan (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaccinerede (Unvacc) med BCG Dansk vaccine 10 6 CFU. (A) til to måneder efter vaccination, blev en cellulær suspension fra høstede lunger opnået. Celler blev stimuleret med PPD som beskrevet i fremgangsmåder sektion og IL17A (venstre panel) og IFNy (højre panel) produktion blev analyseret ved ELISA. (B) Totalt IgA og M. tuberkulose (MTB) -specifik IgA blev analyseret fra BAL-prøver ved ELISA. Samlede data fra to uafhængige forsøg er vist. Data i graferne er repræsenteret som middelværdi + SD. (Tidligere offentliggjort 9). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Vaccine-specifikkePulmonal immunrespons Analyseret før Challenge med H37Rv. Grupper på 6 DBA / 2 mus blev vaccineret ved subkutan (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rute, eller ikke-vaccinerede (NV) med BCG Dansk vaccine 10 6 CFU. En kontrolgruppe af ikke-vaccinerede, ikke-inficerede mus var også inkluderet (NV / NI). Til to måneder efter vaccination blev mus udfordret intranasalt med en lav H37Rv dosis (100 CFU), og en måned senere blev dyrene aflivet. Venstre og højre lunger fra det samme dyr blev anvendt til at bestemme bakteriel belastning og IL17A- (A) eller IFNγ- (B) fremstilling af CD4 + celler. Data i venstre paneler svarer til procentdelen af cytokin-producerende celler målt ved flowcytometri, og er repræsenteret som middelværdi + SD. Højre paneler repræsenterer data fra bakteriel belastning og cytokin- producerende CD4 + celler opnået for hver mus. Lineær regression blev beregnet, og p-værdien opnået i hvert tilfælde er vist i tilfældet med IL17A. Pooleddata fra to uafhængige forsøg er vist i figuren. (Tidligere offentliggjort 9). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L.
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
