Les cellules souches neurales (NNC) se réfèrent à des cellules qui peuvent se renouveler et de se différencier en trois lignées neurales. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la fréquence NSC dans une population cellulaire donnée en utilisant Neurosphère formation et la différenciation dans des conditions clonales.
Les cellules souches neurales (NSC) ont la capacité d'auto-renouvellement et de générer les trois grandes lignées neurales – astrocytes, neurones et les oligodendrocytes. NNC et progéniteurs neuronaux (IP) sont couramment cultivées in vitro comme neurosphères. Ce protocole décrit en détail la façon de déterminer la fréquence NSC dans une population cellulaire donnée dans des conditions clonales. Le protocole commence avec l'ensemencement des cellules à une densité qui permet la génération de neurosphères clonales. Les neurosphères sont ensuite transférées à des lamelles couvre-cloisonnées et différenciées dans des conditions clonale dans un milieu conditionné, ce qui maximise le potentiel de différenciation des neurosphères. Enfin, la fréquence NSC est calculée sur la base de la formation et de multipotence capacités neurosphères. Utilitaires de ce protocole comprennent l'évaluation des candidats marqueurs NSC, la purification de NNC, et la capacité de distinguer NSCs de NPs. Cette méthode prend 13 jours pour effectuer, ce qui est beaucoup sHorter que les méthodes actuelles d'énumérer la fréquence NSC.
Les cellules souches neurales (NNC) sont des cellules du système nerveux central (SNC) qui peut auto-renouveler et sont multipotentes. NNC sont d'abord spécifié au cours du développement du cerveau antérieur embryonnaire et continuent à persister dans le cerveau des adultes à des régions spécifiques telles que la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et le gyrus denté (DG) de l'hippocampe. Un certain nombre de lignes NSC sont utilisés dans des essais cliniques pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux et d' autres maladies neurologiques telles que la maladie de Batten 1.
NNC et progéniteurs neuronaux (IP) se propagent dans la culture comme structures flottantes sphéroïdes 3 dimensions appelées neurosphères. Le système de culture de neurosphères a été développée par Reynolds et Weiss au début des années 1990, quand ils ont découvert que les cellules corticales embryonnaires et adultes peuvent se diviser en présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) 2-4. Neurosphères se composent d'un mélange hétérogène de caunes comprenant des sous – classes à différents stades de développement 5. Il est difficile d'étudier spécifiquement NSCs en utilisant les données obtenues à partir de neurosphères en raison de la présence d'infirmières praticiennes. Par conséquent, il est crucial d'enrichir NSCs de neurosphères. À l' heure actuelle, quatre méthodes principales ont été utilisées pour enrichir NSCs in vitro. La première est l'utilisation de marqueurs de la surface cellulaire. Lewis-X (LEX) et CD133 (également connu sous le nom Prominin1) sont de surface cellulaire le plus important NSC marqueurs 6-9. Syndécane-1, Notch-1 et de l' intégrine bêta 1 sont d' autres protéines de surface qui viennent enrichir pour NNC 10. Deuxièmement, il y a l'exclusion du colorant. Il a été démontré que les cellules côte-populations, qui ont la capacité unique de pomper le colorant fluorescent de liaison à l' ADN Hoechst 33342, sont enrichies en 11 NNC. Troisièmement, l'utilisation de la sélection morphologique. Il a été démontré que les cellules avec un accroissement de la taille des cellules et la granularité port plus NNC que leurs homologues 5,12,13. La quatrième est l'ajout de NSC suLes facteurs rvival au milieu de culture. Il a été démontré que l' addition de sulfate protéoglycane chondroïtine et améliore la survie apolipoprotéine E NSC et augmente ainsi la fréquence NSC 14,15. Bien que de nombreux marqueurs , y compris les facteurs de transcription ont été associés à 16,17 NNC, aucun de ces marqueurs sont capables d'enrichir NNC à la pureté. En raison du manque de marqueurs NSC définitives, il reste un défi de quantifier NNC et de les distinguer des NPs in vitro.
Les premières études ont utilisé le test de formation de neurosphères (NFA) pour quantifier NSCs 7,11,13. Dans cet essai, les cellules dissociées sont cultivées pour former des neurosphères et le nombre de neurosphères générés pour 100 cellules étalées est déterminé. Cette valeur est nommé comme l'Unité de Formation Neurosphère (NFU). La NFU est égale à la fréquence NSC si tous les neurosphères proviennent de NNC. Cependant, il a été montré que la NFU surestime la fréquence NSC neurosphères sont formées par les deux NSCs et au début de NPs 5. Ainsi, il est inexact d'énumérer NSCs uniquement basée sur la formation Neurosphère. Il pourrait être possible de quantifier NSCs en fonction de leur capacité d'auto-renouvellement, prolifèrent abondamment et générer neurosphères multipotentes.
NNC, qui sont EGF et bFGF sensibles, survivent généralement pendant au moins dix passages et donc afficher une vaste capacité d' auto-renouvellement dans la culture 4,18-20. IP, qui sont EGF et bFGF répondant ainsi, pourrait également générer des neurosphères pour quelques passages, mais pas pour une longue période de temps. Par conséquent, il a été largement admis que NSCs de bonne foi peuvent être énumérés avec une précision équitable basée sur la formation Neurosphère pendant au moins dix passages. Dans la plupart des études, cependant, l'auto-renouvellement est généralement mesurée sur la base de la formation de neurosphères secondaire ou tertiaire en raison de la longue période d'expérimentation nécessaire pour dix passages. Par conséquent, la NFA secondaire peut être utilisé pour comparer globalement la capacité d'auto-renouvellement paripopulations ween, mais ne peuvent pas être utilisés pour énumérer avec précision la fréquence NSC.
NNC ont une plus grande capacité proliférative par rapport à NPs. Cette propriété de NNC a été utilisé par Louis et al. mettre au point un essai pour le dénombrement NSC – le dosage de neurones formant colonie cellulaire (NCFCA) 21,22. Dans cet essai, des cellules isolées sont cultivées pendant 3 semaines dans une matrice semi-solide contenant du collagène. Dans ces conditions de culture, il a été montré que les cellules qui forment neurosphères de plus de 2 mm de diamètre sont tripotent et peuvent se renouveler pour le long terme. Ces cellules sont définies comme NNC. Par conséquent, les NNC sont effectivement distingués des infirmières praticiennes.
NNC ont la capacité de se différencier en astrocytes, les oligodendrocytes et les neurones. Pour la différenciation des neurosphères, les facteurs de croissance sont retirés et le sérum est ajouté au milieu de culture. Si les trois lignées neurales sont observées dans une neurosphère, la cellule qui a initié cette neurosphères is un NSC. Toutefois, le test de différenciation a quelques limitations. En premier lieu, les conditions de culture utilisées pour la différenciation peuvent ne pas être optimal pour la génération des trois lignées neurales. En fait, dans un seul processus de différenciation des neurosphères, la mort cellulaire significative se produit et surtout la génération des astrocytes se produit (Tham M et Ahmed S, non publié). Deuxièmement, il y a la question de la clonalité. Pour le dénombrement précis de NNC, la formation et la différenciation des neurosphères doivent être réalisées dans des conditions clonales, où chaque Neurosphère surgit d'une seule cellule. Dans les cultures de suspension en vrac, l' agrégation se produit aux niveaux cellulaires et neurosphères 23-25. Par conséquent, il est possible pour chaque neurosphères, provenir de cellules ou de neurosphères multiples, ce qui complique le comptage et l'évaluation de multipotence neurosphères. Des données récentes montrent que l'agrégation des cellules ne se produit pas à une faible densité de placage de 0,5 cellules / ul ou au-dessous, et lorsque des plaques de culture ne sont pas déplacées pendant neuformation rosphere 15. Ainsi la culture de cellules à cette faible densité assurerait clonalité.
Actuellement, le NCFCA est la méthode la plus couramment utilisée pour distinguer NSCs de NPs et d'énumérer la fréquence NSC. Le NCFCA, cependant, nécessite un temps relativement long de trois semaines. Ici, nous décrivons un protocole d'énumérer la fréquence NSC basée sur la capacité de NNC pour former neurosphères multipotentes. Ce protocole prend seulement 13 jours pour effectuer. NCFCA assure la clonalité que la matrice de collagène empêche le mouvement des neurosphères. Les conditions de culture utilisées dans ce protocole permet également clonalité d'être maintenue tout au long. Par exemple, l'utilisation de 50 puits lamelles chambré assure que les neurosphères se différencier sans contact les unes avec les autres. De plus, nous utilisons moyenne qui fournit des facteurs neurotrophiques lors de la différenciation pour maximiser le potentiel de différenciation des neurosphères (figure 1) conditionnés.
Nous décrivons hee l'énumération des NSCs dans des conditions clonales. Les étapes critiques comprennent l'utilisation d'un milieu frais de croissance et de différenciation NSC, ainsi que l'utilisation d'une solution fraîchement préparée de PLL / laminine pour enrober les lamelles chambré, ainsi que des boîtes de culture. Ceci garantit des conditions de croissance et de différenciation optimales des neurosphères. L'utilisation de bonnes qualité d'anticorps pour détecter efficacement les neurones et les cellules gliales, ainsi que le prélèvement sélectif de neurosphères clonales qui ne sont pas en contact avec d'autres neurosphères, sont critiques. En outre, il est important de garantir que les neurosphères cueillies ne tarissent pas. Il est recommandé d'ajouter 10 pi de milieu de différenciation à chaque puits après la cueillette tous les 10 neurosphères. Il est important d'utiliser une lamelle chambré dans un plat de 10 cm par échantillon pour éviter la diaphonie entre neurosphères de différents échantillons. Si deux lamelles (contenant chacun neurosphères à partir de différents échantillons) sont placés dans lemême boîte de 10 cm, neurosphères de l'une lamelle pourrait libérer des facteurs qui peuvent modifier la propension des neurosphères dans l'autre lamelle de se différencier en lignées spécifiques. Deux lamelles couvre-objet dans la même boîte de 10 cm peuvent également entraîner confusion entre les échantillons.
Dans le cas où le NFU ou la fréquence NSC est plus faible que prévu, veiller à ce que nombre faible passage neurosphères sont utilisés. Il est également important que neurosphères bas de passage en bonne santé sont utilisés pour produire un milieu conditionné. Ensuite, si les neurosphères sont cultivées dans des puits de petit diamètre, comme dans un plat de 96 puits, alors il sera difficile à manœuvrer et choisir neurosphères en utilisant une micropipette. Dans ce cas, transférer les neurosphères à une boîte de culture plus vaste, comme un plat à 6 puits, avant la cueillette. Certains des neurosphères cueillies peut décoller de la lamelle chambré pendant la culture et immunocoloration. Minimiser le mouvement de la lamelle chambré pendant la culture, et lavage moins intensiveing pendant immunocoloration, contribuerait à éviter le détachement de neurosphères.
Les premières études quantifiées NSCs en utilisant uniquement la NFA 7,11,13. Cependant, la NFA surestime la fréquence NSC à la fois comme NNC et au début des NPs génèrent neurosphères 5. Louis et al. A développé une autre méthode pour quantifier NSCs connu sous le nom NCFCA 21,22. La NCFCA consiste à cultiver des cellules individuelles dans une matrice à base de collagène pour assurer la clonalité, et il a été montré que neurosphères au-dessus de 2 mm de diamètre sont formés uniquement par NNC. Semblable à la NCFCA, clonalité est assurée tout au long de ce protocole. Ce résultat est obtenu en générant des neurosphères à une densité clonale et la différenciation des neurosphères à lamelles chambré. L'utilisation de lamelles chambré confère un certain nombre d'avantages. La lamelle chambré permet à chaque échantillon Neurosphère de différencier sans avoir un contact physique avec d'autres neurosphères d'échantillons, assurant ainsi clonalité lors de la différenciation.La lamelle couvre-chambré peut être mis en suspension dans le milieu de différenciation pour permettre neurosphères échantillon à conditionner en continu et pour assurer une différenciation maximale. En l'absence de milieu conditionné et le sérum pendant la différenciation, la survie des neurosphères diminue et que la plupart des neurosphères générer astrocytes (M Tham et Ahmed S, non publié). En outre, les neurosphères immunocolorées peuvent être facilement stockés pendant une longue période de temps et les lamelles chambré peuvent être montés directement sur les lames de verre de microscope. En outre, l'imagerie des neurosphères immunocolorées est facile comme on peut rapidement localiser l'Neurosphère dans le petit puits chambré, capturer une image, et de passer à la prochaine bien.
Nous avons déterminé la fréquence NSC dans E14.5 culture de neurosphères de souris à l' aide à la fois le protocole décrit dans ce manuscrit 27 et NCFCA 28. La fréquence NSC en neurosphères de souris E14.5 déterminé à la fois par moithodes sont comparables. Le NCFCA énumère NSCs qui sont multipotentes et ont la capacité d'auto-renouvellement à long terme. Comme la fréquence NSC à partir de notre méthode est comparable à celle de NCFCA, la lecture de notre protocole ne semble pas surestimer la fréquence NSC. Le NCFCA nécessite trois semaines à remplir et concerne principalement le placage cellulaire et reconstitution moyenne. Le protocole décrit ici nécessite 13 jours pour réaliser et implique une autre série d'étapes, par exemple, Neurosphère picking et immunocoloration. Ce protocole pourrait servir comme une méthode alternative pour énumérer NSCs. Les chercheurs peuvent utiliser à la fois NCFCA et ce protocole pour vérifier la fréquence NSC dans leurs échantillons.
Une limitation de ce protocole est qu'une série de mesures importantes doivent être toutes effectuées le jour 8. La préparation du milieu conditionné, la détermination de NFU de neurosphères de l'échantillon, et le transfert de neurosphères de l'échantillon à la lamelle 50 puits chambré doivent être réalisée sur day 8. On peut prendre du temps pour effectuer ces étapes. En outre, il exige de la pratique pour effectuer ces étapes d'une manière efficace.
Neurosphères ont été largement utilisés pour étudier la fonction NSC et de comportement. Cependant, neurosphères se composent de deux NNC et NPs. Par conséquent, il est important d'enrichir NSCs de neurosphères pour étudier la biologie NSC. À l' heure actuelle, les marqueurs de surface cellulaire, des propriétés d'exclusion de colorant ainsi que la taille des cellules et la granularité ont été utilisées pour enrichir NNC 6,7,9-13,29,30. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier l'enrichissement de NNC par des marqueurs potentiels NSC, et de faciliter la recherche d'un marqueur NSC définitif. Quatre études récentes ont utilisé ce protocole pour énumérer la fréquence NSC 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions l'Agence pour la science, la technologie et la recherche (A * STAR), Singapour pour financer cette recherche.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |