Micropatterning وجمعية Microvessels 3D
Summary
تقدم هذه المخطوطة طريقة حقن صب مهندس microvessels أن ألخص الخصائص الفسيولوجية للالبطانة. العملية المستندة ميكروفلويديك تخلق شبكات الأوعية الدموية براءات الاختراع 3D مع الظروف tailorable، مثل تدفق والتكوين الخلوي، والهندسة، والتدرجات الكيميائية الحيوية. ووصف عملية التصنيع وأمثلة من التطبيقات المحتملة.
Abstract
في منصات المختبر لدراسة الخلايا البطانية والبيولوجيا الوعائية تقتصر إلى حد كبير إلى 2D زراعة الخلايا البطانية، وتدفق غرف مع البوليمر أو ركائز الزجاج مقرها، والمقايسات تشكيل أنبوب القائم على هيدروجيل. هذه المقايسات، في حين بالمعلومات، لا ألخص الهندسة التجويف، المصفوفة خارج الخلية المناسبة، والقرب عديد الخلايا، التي تلعب دورا رئيسيا في تحوير وظيفة الأوعية الدموية. توضح هذه المخطوطة طريقة الحقن لتوليد الأوعية هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة Microvessels من البذر الخلايا البطانية في قناة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من ضمن نوع أصلي أنا الكولاجين هيدروجيل. من خلال دمج الخلايا متني داخل المصفوفة الكولاجين السابقة لتوجيه تشكيل، microenvironments الأنسجة محددة يمكن أن تكون على غرار ودراستها. التحويرات إضافية من خصائص وسائل الإعلام الهيدروديناميكية تكوين تسمح للسيطرة على وظيفة الأوعية الدموية المعقدة داخل المكروية المطلوب.هذا البرنامج يسمح لدراسة توظيف ماحول الأوعية الخلايا، التفاعلات الدم البطانة، استجابة التدفق، والتفاعلات الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة. microvessels هندسيا توفر القدرة على عزل تأثير من المكونات الفردية من مكانة الأوعية الدموية وعلى وجه التحديد المكافحة الكيميائية والميكانيكية والخصائص البيولوجية لدراسة علم الأحياء الأوعية الدموية في كل من الصحة والمرض.
Introduction
في الأوعية الدموية الدقيقة في كل جهاز يساعد على تحديد المكروية الأنسجة، والحفاظ على توازن الأنسجة وتنظيم التهاب، النفاذية، تخثر الدم، وانحلال الفيبرين 1،2. البطانة الاوعية الدموية الدقيقة، على وجه الخصوص، هو واجهة بين تدفق الدم والأنسجة المحيطة بها، وبالتالي تلعب دورا حاسما في تحوير الأوعية الدموية وظيفة الجهاز استجابة للمؤثرات مثل القوات الهيدروديناميكية والسيتوكينات تعميم والهرمونات 3-5. فهم التفاعلات مفصلة بين البطانة، والدم، والمكروية الأنسجة المحيطة هامة لدراسة البيولوجيا الوعائية وتطور المرض. ومع ذلك، فقد أعاقت التقدم في دراسة هذه التفاعلات التي تقتصر في أدوات المختبر التي لا ألخص في بنية الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وتعمل 6،7. ونتيجة لذلك، اعتمدت الميدان والتقدم العلاجي بشكل كبير على تكلفة وقت-تستهلك النماذج الحيوانية التي غالبا ما تفشل في ترجمة النجاح في البشر 8-10. بينما في النماذج الحية لا تقدر بثمن في دراسة آليات المرض وظائف الأوعية الدموية، فهي معقدة وغالبا ما تفتقر إلى مراقبة دقيقة من الأفراد الخلوي، والكيمياء الحيوية، والعظة الفيزيائية الحيوية.
الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجسم يمتلك بنية هرمية ناضجة بالتعاون مع أسرة الشعرية توسعية، وتوفير نضح الأمثل ونقل المواد الغذائية في وقت واحد 11. في البداية، أشكال الأوعية الدموية كما ضفيرة البدائية التي تعيد ترتيب لشبكة متفرعة هرميا خلال التنمية في وقت مبكر 12،13. على الرغم من أن العديد من إشارات تشارك في هذه العمليات مفهومة جيدا 14-16، فإنه لا يزال بعيد المنال كيف يمكن لهذا يتم تحديد الزخرفة الوعائية 15. بدوره، تلخص هذه العملية في المختبر لمهندس شبكات الأوعية الدموية المنظمة لديها النحلن العديد من في المختبر المنصات الموجودة صعبة. لنموذج الأوعية الدموية، مثل اثنين من الأبعاد مزارع الخلايا البطانية، تفتقر إلى الخصائص المهمة مثل القرب عديد الخلايا، ثلاث الهندسة اللمعية الأبعاد، تدفق، والمصفوفة خارج الخلية. وقد استخدمت 19 أو غزو المقايسات 20،21 لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في 3D وتفاعلاتها مع غيرها من الأوعية الدموية 17،22 أو خلية الأنسجة أنواع 23 – أنبوب المقايسات تشكيل في الهلاميات المائية 3D (الكولاجين أو الفيبرين) 17. ومع ذلك، وتجميعها شمعة في هذه المقايسات تفتقر إلى الترابط، وتدفق الدورة الدموية، ونضح المناسب. وعلاوة على ذلك، والميل للتراجع الأوعية الدموية في هذه أنبوب المقايسات تشكيل 24 يمنع الثقافة على المدى الطويل والنضج مما يحد من درجة الدراسات الفنية التي يمكن القيام بها. وبالتالي، هناك حاجة المتزايدة لمهندس في المختبر منصات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي يمكن أن نموذج بشكل مناسب أونdothelial خصائص وقابلة للثقافة على المدى الطويل.
ظهرت مجموعة متنوعة من تقنيات الهندسة الأوعية الدموية على مر السنين للتطبيقات الطبية لاستبدال أو السفن تجاوز المتضررة في المرضى الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية. وكان سفن القطر كبيرة مصنوعة من مواد تركيبية مثل البولي اثيلين البولي (PET)، وتترافلوروإيثيلين (EPTFE) نجاح علاجي كبير مع طويلة المدى المباح (متوسط 95٪ المباح أكثر من 5 سنوات) 25. على الرغم من القطر الصغير الطعوم الاصطناعية (<6 ملم) تواجه عادة مضاعفات مثل تضخم باطنة وتكون الصفيحات 26 – 28، الأنسجة المهندسة الطعوم صغيرة قطرها المصنوع من المواد البيولوجية قد حققت تقدما كبيرا 29،30. وعلى الرغم من التقدم من هذا النوع، وظلت السفن هندسيا على الميكروسكيل تحديا. لنموذج بشكل كاف الأوعية الدموية الدقيقة، فمن الضروري لتوليد أنماط شبكة معقدة مع SUFficient القوة الميكانيكية للحفاظ على المباح ومع تكوين مصفوفة التي تسمح لكل من نفاذ المواد الغذائية للخلايا متني وإعادة عرض الخلوية.
ويعرض هذا البروتوكول الاصطناعية شبكة الأوعية perfusable الرواية التي يحاكي مواطن في الجسم الحي وضع مع الانضباطي والسيطرة عليها المكروية 31-34. الطريقة الموصوفة يولد microvessels هندسيا مع قطر بناء على أمر من 100 ميكرون. هي ملفقة microvessels التي صممتها perfusing الخلايا البطانية من خلال قناة ميكروفلويديك مضمن ضمن نوع لينة أنا الكولاجين هيدروجيل. هذا النظام لديه القدرة على توليد شبكات نمط مع هيكل اللمعية مفتوحة، وتكرار التفاعلات متعددة الخلايا، تعدل خارج الخلية تكوين مصفوفة، وتطبيق قوات الدورة الدموية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
microvessels المهندسة هي نموذج في المختبر حيث الخصائص الفسيولوجية مثل الهندسة اللمعية، قوات الهيدروديناميكية، والتفاعلات متعددة الخلايا موجودة والانضباطي. هذا النوع من منصة قوية لأنه يوفر القدرة على نموذج ودراسة السلوك البطانية في مجموعة متنوعة من السياقات التي ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه لين ومختبر التصوير غارفي مايك في معهد الخلايا الجذعية والطب التجديدي وكذلك مرفق واشنطن Nanofabrication في جامعة واشنطن. كما ينوه بالدعم المالي من المعهد الوطني للصحة منح DP2DK102258 (لYZ)، والتدريب يمنح T32EB001650 (لSSK وMAR) وT32HL007312 (لMAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
