Micropatterning og montering av 3D microvessels
Summary
Dette manuskriptet presenterer en injeksjon metode for å konstruere microvessels at rekapitulere fysiologiske egenskapene til endotelet. Den mikrofluidbasert prosess skaper patent 3D-vaskulære nettverk med tailorable tilstander, slik som flyt, cellesammensetning, geometri, og biokjemiske gradienter. Fremstillingsprosessen og eksempler på potensielle anvendelser beskrives.
Abstract
In vitro-plattformer for å studere endotelceller og vaskulær biologi er i stor grad begrenset til 2D endotelial cellekultur, strømningskamre med polymer- eller glassbaserte substrater, og hydrogel-baserte rør formasjons analyser. Disse analysene, mens informativ, ikke rekapitulere lumen geometri, riktig ekstracellulære matrise, og multi-cellular nærhet, som spiller sentrale roller i moduler vaskulær funksjon. Dette manuskriptet beskriver en sprøytestøpemetode for å generere konstruerte fartøyer med diameter i størrelsesorden 100 mikrometer. Microvessels er fabrikkert ved såing av endotelceller i et mikrofluidkanal integrert i en naturlig type I kollagen hydrogel. Ved å innlemme parenkymceller i kollagenmatriksen før kanaldannelse kan spesifikke vev microenvironments modelleres og undersøkt. Ytterligere modulasjoner av hydrodynamiske egenskaper og media sammensetning gir mulighet for styring av komplekse vaskulær funksjon innenfor den ønskede mikromiljøet.Denne plattformen gjør det mulig for studiet av perivaskulær celle rekruttering, blod-endotel interaksjoner, strømrespons, og vev-mikrovaskulær interaksjoner. Konstruert microvessels tilbyr muligheten til å isolere påvirkningen fra enkelte komponentene i en vaskulær nisje og presist kontrollere dens kjemiske, mekaniske og biologiske egenskaper til å studere vaskulær biologi i både helse og sykdom.
Introduction
Microvasculature i hvert organ bidrar til å definere vevet mikromiljøet, vedlikeholde vev homeostase og regulerer betennelse, permeabilitet, trombose, og fibrinolyse 1,2. Mikrovaskulær endotel, i særdeleshet, er grensesnittet mellom blodstrømmen og det omgivende vev, og derfor spiller en avgjørende rolle i modulering av vaskulær og organfunksjon som reaksjon på stimuli slik som hydrodynamiske krefter og sirkulerende cytokiner og hormoner 3 – 5. Å forstå den detaljerte vekselvirkninger mellom endotelet, blod, og det omkringliggende vevet mikro er viktig for studiet av vaskulær biologi og sykdomsprogresjon. Men fremgang i å studere disse interaksjoner har blitt hindret av begrenset in vitro-verktøy som ikke rekapitulere in vivo mikrovaskulær struktur og funksjon 6,7. Som et resultat, har feltet og terapeutiske fremskritt støttet seg tungt på kostbare og tidskonsumere dyremodeller som ofte ikke klarer å oversette til suksess i mennesker 8 – 10. Selv om in vivo-modeller er uvurderlig i studiet av sykdomsmekanismer og vaskulære funksjoner, de er komplekse og ofte mangler nøyaktig kontroll av individuelle celle, biokjemiske og biofysiske signaler.
Blodkar i hele kroppen besitter en moden hierarkisk struktur i forbindelse med ekspansive kapillære senger, gir optimal perfusjon og næringstransport samtidig 11. I utgangspunktet blodkar former som en primitiv plexus som reorganiserer til en hierarkisk forgrenet nettverk under tidlig utvikling 12,13. Selv om mange av de som er involvert i disse prosessene signalene blir godt forstått 14-16, gjenstår det unnvikende hvordan en slik vaskulær mønstring bestemmes 15. I sin tur, rekapitulere denne prosessen in vitro til ingeniør organiserte vaskulære nettverk har been vanskelig. Mange eksisterende in vitro-plattformer for å modellere blodkar, for eksempel todimensjonale endoteliale cellekulturer, mangler viktige egenskaper som multi-cellulær nærhet, tre-dimensjonal geometri luminal, strømning, og ekstracellulær matriks. Tube formasjons analyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 – 19 eller invasjon analyser 20,21 har blitt brukt til å studere endotelfunksjon i 3D og deres samhandling med andre vaskulære 17,22 eller vev celletyper 23. Men samlet lumen i disse analysene mangler tilkoblinger, hemodynamisk flyt, og passende perfusjon. Videre er det tilbøyelighet for vaskulær regresjon i disse rør formasjons assays 24 hindrer at langtidskultur og modning som begrenser graden av funksjonelle studier som kan utføres. Dermed er det en gryende behov for å konstruere in vitro plattformer av mikrovaskulære nettverk som kan hensiktsmessig modellere nodothelial egenskaper og er i stand til langvarig kultur.
En rekke vaskulære engineering teknikker har dukket opp gjennom årene for medisinsk bruk for å erstatte eller bypass påvirket fartøy hos pasienter med vaskulær sykdom. Stor diameter fartøy laget av syntetiske materialer slik som polyetylentereftalat (PET), og polytetrafluoretylen (ePTFE) har hatt betydelig terapeutisk suksess med langvarig åpenhet (gjennomsnittlig 95% åpenhets over 5 år) 25. Selv små diameter syntetiske transplantater (<6 mm) typisk møte komplikasjoner som intimal hyperplasi og trombopoiese 26-28, vev konstruert liten diameter grafts laget med biologisk materiale har gjort betydelige fremskritt 29,30. Til tross for fremskritt av denne typen, har utviklet fartøy på mikro forble en utfordring. Å tilstrekkelig modellere mikrovaskulaturen, er det nødvendig å generere komplekse nettverksmønster med sufkelig mekanisk styrke til å opprettholde åpenhet og med en matriseblanding som gjør det mulig for både næringsgjennomtrengning for parenchymale celler og cellulære remodeling.
Denne protokollen presenterer en ny kunstig perfusable fartøy nettverk som etterligner en innfødt in vivo setting med en fleksibel og kontrollerbar mikromiljøet 31-34. Den beskrevne metoden genererer konstruerte microvessels med diameter i størrelsesorden 100 mikrometer. Konstruert microvessels er fabrikkert av perfusert endotelceller gjennom et mikrofluidkanal som er innleiret i myk type I kollagen hydrogel. Dette systemet har kapasitet til å generere mønstrede nettverk med åpen luminal struktur, replikere flercellede interaksjoner, modulere ekstracellulære matrise sammensetning, og anvende fysiologisk relevante hemodynamiske krefter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konstruert microvessels er en in vitro modell der fysiologiske egenskaper som luminal geometri, hydrodynamiske krefter, og flercellede interaksjoner er til stede og fleksibel. Denne type plattform er kraftig ved at den gir mulighet til å modellere og studere endothelial atferd i en rekke sammenhenger der vitro dyrkningsforholdene i kan matches til at av mikromiljøet i spørsmålet. For eksempel, de mekanismer som driver endoteliale prosesser, slik som angiogenese, er kjent for å forekomme p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institutt for Stem Cell og regenerativ medisin samt Washington Nanofabrication Facility ved University of Washington. De erkjenner også økonomisk støtte fra National Institute of Health gir DP2DK102258 (til YZ), og trening gir T32EB001650 (til SSK og MAR) og T32HL007312 (til MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
