की जांच के लिए एक अधिक संवेदनशील और विशिष्ट chromogenic अगर मध्यम का विकास<em> विब्रियो parahaemolyticus</em> और अन्य<em> विब्रियो</em> प्रजाति
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
अमेरिका विब्रियो प्रजातियों की वजह से में खाद्य जनित संक्रमण के एक वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई है। जीनस में विब्रियो, वी parahaemolyticus विब्रियो -associated संक्रमण के बहुमत के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, विब्रियो एसपीपी के बीच सटीक भेदभाव। और वी का पता लगाने के parahaemolyticus हमारे भोजन की आपूर्ति की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि आणविक तकनीक तेजी से आम है, संस्कृति के आधार तरीकों अभी भी नियमित रूप से किया जाता है और वे कुछ निश्चित परिस्थितियों में मानक तरीकों पर विचार कर रहे हैं। इसलिए, एक उपन्यास chromogenic अगर मध्यम अलगाव और चिकित्सकीय प्रासंगिक विब्रियो एसपीपी के भेदभाव के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करने के लक्ष्य के साथ परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल वी का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता, विशिष्टता और सीमा का पता लगाने की तुलना नई chromogenic मध्यम और एक पारंपरिक मध्यम बीच parahaemolyticus। विभिन्न वी parahaemolyticus उपभेदों (एन = 22) फिर सेविविध सीरमप्रकारों और मूल के स्रोत पेश इस्तेमाल किया गया। वे इससे पहले, खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र (सीडीसी) द्वारा की पहचान की गई है और आगे tlh -PCR से हमारी प्रयोगशाला में सत्यापित। कम से कम चार अलग-अलग परीक्षणों में, इन उपभेदों 24 के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर chromogenic अगर और thiosulfate-साइट्रेट-पित्त लवण-सुक्रोज (TCBS) अगर है, जो इस प्रजाति के संवर्धन के लिए सिफारिश माध्यम है, ऊष्मायन द्वारा पीछा पर टीका कर रहे थे -96 घंटा। तीन वी parahaemolyticus उपभेदों (13.6%) TCBS पर बेहतर हो जाना नहीं था, फिर भी हरे रंग की कालोनियों का प्रदर्शन किया है, तो वहाँ विकास किया गया था। दो उपभेदों (9.1%) chromogenic अगर पर उम्मीद सियान कालोनियों उपज नहीं था। गैर-वी parahaemolyticus उपभेदों (एन = 32) भी chromogenic अगर की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया गया। इन उपभेदों के बीच, 31 के बढ़ने या अन्य कॉलोनी morphologies का प्रदर्शन नहीं किया था। वी का मतलब वसूली chromoge पर parahaemolyticusएनआईसी अगर ~ 2% सोडियम क्लोराइड के साथ पूरक tryptic सोया अगर करने के लिए 96.4% रिश्तेदार था। अंत में, नई chromogenic अगर वी पता लगाने के लिए एक प्रभावी माध्यम है parahaemolyticus और अन्य vibrios से अलग करने के लिए।
Introduction
विब्रियो जीनस, वी के एक सदस्य के रूप में parahaemolyticus एक ग्राम नकारात्मक, गैर बीजाणु बनाने, घुमावदार, छड़ के आकार का जीवाणु है। यह दोनों तरल और अर्ध ठोस वातावरण में उच्च गतिशीलता को दर्शाती है। अधिकांश वी parahaemolyticus उपभेदों मनुष्य के लिए गैर रोगजनक हैं, फिर भी रोगजनक उपप्रकार कई देशों 1,2 में महामारी और महामारियां, इसलिए इस प्रजाति एक महत्वपूर्ण खाद्य जनित रोगज़नक़ माना जाता है कारण है। अमेरिका में विब्रियो संक्रमण की घटनाओं विब्रियो एसपीपी के अलावा 2000 3 के बाद एक वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई है।।, वी parahaemolyticus सबसे अक्सर रिपोर्ट अमेरिका 4,5 में बीमारियों के कारण प्रजातियों है। अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रजातियों वी शामिल alginolyticus, वी vulnificus, वी कोलरा, आदि बीमारियों की एक छोटा सा प्रतिशत एक साथ कई प्रजातियों के कारण होता है।
वी parahaemolyticus एक प्राकृतिक रहा हैसमुद्री पानी की nhabitant और इसलिए व्यापक रूप ज्वारनदमुख सहित दुनिया भर में समुद्री जल में वितरित की। प्रजातियों जापान में विषाक्त भोजन का प्रकोप निम्नलिखित 1950 में पता चला था। अमेरिका में, प्रजातियों पहले Puget ध्वनि क्षेत्र 6.7 में समुद्री जल, अवसादों, और शंख में पृथक किया गया। ऐसे दोपटा शंख के रूप में समुद्री निवास में फिल्टर भक्षण, वी कर सकते हैं बंदरगाह उनके प्राकृतिक वनस्पतियों 8 के हिस्से के रूप parahaemolyticus। इस तरह, वी के रूप में मानव में parahaemolyticus संक्रमण अक्सर दूषित समुद्री भोजन, विशेष रूप से कच्चा या अधपका शंख की खपत से जुड़ी हैं। प्रवेश की एक कम आम मार्ग तब होता है जब खुला घाव समुद्री जल के संपर्क में है, त्वचा संक्रमण के लिए अग्रणी। अधिकांश वी parahaemolyticus उपभेदों मानव रोग का कारण नहीं है, अभी तक इस तरह थर्मास्टाइबल प्रत्यक्ष hemolysin (TDH) के रूप में विषैलापन कारकों को शरण देने के लिए कुछ उपप्रकार रोगजनक हैं। खाद्य जनित वी का सबसे प्रचलित लक्षण parahaemolyticus संक्रमण हैंदस्त और पेट दर्द, द्वारा मतली, उल्टी, बुखार और पीछा किया। सिरदर्द और ठंड लगना भी रिपोर्ट कर रहे हैं। मंझला ऊष्मायन अवधि 15 घंटा है, लेकिन रोगजनक उपभेदों 9 के लिए पर्याप्त राशि की खपत के बाद 96 घंटा के लिए हो सकता है। बीमारी दो से तीन दिन से रहता है। आंत्रशोथ वी के कारण लक्षण parahaemolyticus काफी हद तक खुद को सीमित कर रहे हैं और इसलिए विशेष इलाज के लिए आवश्यक नहीं है। आंत्रशोथ के हल्के मामलों को प्रभावी ढंग से मौखिक पुनर्जलीकरण द्वारा इलाज किया जा सकता है। अधिक गंभीर बीमारियों ऐसे टेट्रासाइक्लिन या सिप्रोफ्लोक्सासिन 10 के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं से इलाज किया जा सकता है। मृत्यु दर आंत्रशोथ के मामलों के लिए के बारे में 2% है, लेकिन जो लोग खून के संक्रमण या सेप्टीसीमिया के विकास के लिए 29% के रूप में उच्च हो सकता है। कोई भी व्यक्ति जो समुद्री भोजन की खपत या है समुद्री जल के संपर्क में खुला घाव वी के खतरे में है parahaemolyticus संक्रमण। बीमारियों, जीवन के लिए खतरा सेप्टीसीमिया के और अधिक गंभीर रूप है, अंतर्निहित चिकित्सा सह के साथ एक उप-जनसंख्या में अधिक आम हैnditions 11 है, जो शराब, यकृत रोग, मधुमेह, गुर्दे की बीमारी, दुष्टता, और अन्य शर्तों के एक कमजोर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी शामिल हैं। विशेष रूप से, व्यक्तियों के इस समूह वी की वजह से गंभीर बीमारियों से ग्रस्त होने के लिए एक उच्च जोखिम में भी है vulnificus, वी के समान प्राकृतिक निवास में पाया जा सकता है parahaemolyticus।
वी parahaemolyticus नियमित रूप से एक चयनात्मक और अंतर माध्यम के रूप में thiosulfate-साइट्रेट-पित्त लवण-सुक्रोज (TCBS) अगर उपयोग कर अलग किया जाता है। क्षारीय peptone पानी में संवर्धन TCBS अगर पर अलगाव आरंभ कर सकते हैं। TCBS पर प्रकल्पित कालोनियों तो आगे जैव रासायनिक परीक्षण और / या आणविक assays प्रजाति विशिष्ट जीन की उपस्थिति को निशाना बनाने का एक सरणी में परीक्षण कर रहे हैं। पीसीआर आधारित तरीकों अक्सर वी की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं thermolabile hemolysin जीन amplifying, tlh 12 से parahaemolyticus।
चर्चा के बावजूदपुष्टि तरीकों के OICE, यह अलग और वी अंतर करने के लिए एक प्रभावी माध्यम के लिए महत्वपूर्ण है पहली जगह में अन्य समुद्री vibrios से parahaemolyticus। TCBS नियमित तौर पर उनकी क्षमता सुक्रोज 12 विक्षोभ के अनुसार विब्रियो जीनस के भीतर प्रजातियों अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सकारात्मक प्रतिक्रिया किण्वन पीएच सूचक Bromothymol नीले रंग का एक रंग बदलने के साथ है। वी parahaemolyticus कालोनियों TCBS पर काफी विशिष्ट हैं, हरे रंग के लिए नीले रंग का प्रदर्शन। हालांकि, इस माध्यम आसानी वी अंतर नहीं कर सकते alginolyticus और वी कोलरा। सुक्रोज-fermenting बदलनेवाला प्रजाति पीले कालोनियों वी जैसी उत्पादन हो सकता है कोलरा या वी alginolyticus 13। TCBS, वी पर प्रारंभिक अलगाव पर parahaemolyticus भी Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, और स्यूडोमोनास एसपीपी 14 के रूप में गलत पहचान की जा सकती है। देरी सुक्रोज Ferm साथ उपभेदोंप्रलेखन अन्य सुक्रोज nonfermenting विब्रियो 13 है, जो वी शामिल है के साथ भ्रमित हो सकता है parahaemolyticus। TCBS कोलाई, स्यूडोमोनास putrefaciens, दूसरों के बीच के खिलाफ संवेदनशील नहीं हो पाया था। कई अन्य प्रजातियों ग्रे कालोनियों जो संभवतः वी के साथ भ्रमित कर रहे हैं करने के लिए हरी उपज parahaemolyticus या वी vulnificus 15। नतीजतन, यह वांछनीय है का पता लगाने और वी को अलग-थलग करने की ओर बेहतर संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ वैकल्पिक संस्कृति विकसित करने के लिए मीडिया parahaemolyticus और अन्य निकट से संबंधित प्रजातियों।
कई मीडिया विकल्प के हाल ही में विकसित किया गया है। चयनात्मक एजेंटों के शामिल किए जाने के अलावा, ज्यादातर ने अपने अंतर enzymatic गतिविधियों पर आधारित प्रजातियों अंतर करने के लिए chromogenic substrates शामिल। उदाहरण के लिए, indoxyl-β-glucoside और indoxyl-β-galactoside वी अंतर करने के लिए chromogenic substrates के रूप में इस्तेमाल किया गया है पैरावी के उन लोगों से haemolyticus कालोनियों (जो दिखाई नीले-हरे रंग का) कोलरा (बैंगनी) उनके अंतर क्षमताओं की वजह से β-ग्लुकोसिडेस और β-galactosidase 16 उपज है। Chromogenic अगर के विभिन्न योगों के कई समूहों द्वारा विकसित मूल्यांकन किया गया है और करने के लिए तुलनात्मक या TCBS 17,18,19 की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने के लिए सूचित किया गया। एक chromogenic माध्यम का उपयोग कर का एक लाभ यह है कि आसपास के माध्यम के रंग जिससे विशेष रूप से कालोनियों के अलगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए कम से कम है। इस अध्ययन में, हम पता लगाने और वी अलग करने के लिए एक नव तैयार की chromogenic माध्यम की क्षमता का मूल्यांकन कोलरा, वी parahaemolyticus, और वी vulnificus; वी अंतर करने की क्षमता पर विशेष ध्यान देने के साथ अन्य प्रजातियों से parahaemolyticus।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन संस्कृति मीडिया के विकास और मूल्यांकन पर केंद्रित है। चयनात्मक पारंपरिक, TCBS है और मध्यम अलग और पता लगाने के लिए इस्तेमाल वी अंतर parahaemolyticus, कोलरा और वी vulnificus 12। हालांकि, इस तरह के सीमा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस परियोजना पर उनकी सहायता के लिए एम Channey, ई चौधरी, और लालकृष्ण टॉमस धन्यवाद। परियोजना आपूर्ति आंशिक रूप से कैलिफोर्निया पॉलिटेक्निक द्वारा वित्त पोषित कर रहे थे स्टेट यूनिवर्सिटी।
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
