Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Y Otros<em> Vibrio</em> Especies
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Infecciones transmitidas por los alimentos en los EE.UU. causada por especies de Vibrio han mostrado una tendencia al alza. En el género Vibrio, V. parahaemolyticus es responsable de la mayoría de las infecciones -asociado Vibrio. Por lo tanto, la diferenciación precisa entre Vibrio spp. y la detección de V. parahaemolyticus es de vital importancia para garantizar la seguridad de nuestro suministro de alimentos. Aunque las técnicas moleculares son cada vez más comunes, métodos de cultivo a dependiendo todavía de forma rutinaria hecho y que se consideran métodos estándar en determinadas circunstancias. Por lo tanto, un nuevo medio de agar cromogénico fue probado con el objetivo de proporcionar un mejor método para el aislamiento y la diferenciación de Vibrio spp clínicamente relevante. El protocolo compara el límite de sensibilidad, especificidad y de detección para la detección de V. parahaemolyticus entre el nuevo medio cromogénico y un medio convencional. Varios V. parahaemolyticus cepas (n = 22) de reSe han usado presentar diversos serotipos y de la fuente de origen. Ellos fueron identificados previamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), y verificado aún más en nuestro laboratorio por TLH-PCR. En por lo menos cuatro ensayos separados, estas cepas se inocularon en el agar y tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa cromogénicos (TCBS) de agar, que es el medio recomendado para el cultivo de esta especie, seguido de incubación a 35-37 ° C durante 24 h -96. Tres V. parahaemolyticus cepas (13,6%) no crecieron de manera óptima en TCBS, no obstante, exhibieron colonias de color verde si había crecimiento. Dos cepas (9,1%) no dieron los esperados cian colonias en el agar cromogénico. V. no cepas parahaemolyticus (n = 32) también se probaron para determinar la especificidad de la agar cromogénico. Entre estas cepas, 31 no crecieron o exhibieron otras morfologías de colonias. La recuperación media de V. parahaemolyticus en el chromogenic agar fue de ~ 96,4% en relación con agar de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl. En conclusión, el nuevo agar cromogénico es un medio eficaz para detectar V. parahaemolyticus y para diferenciarlo de otros vibrios.
Introduction
Como miembro del género Vibrio, V. parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativas, no formadoras de esporas, curvada, en forma de barra. Se presenta una alta movilidad en ambos ambientes líquidos y semisólidos. La mayoría V. parahaemolyticus cepas no son patógenos para los seres humanos, sin embargo, los subtipos patógenos han causado epidemias y pandemias, por lo tanto, esta especie se considera que es un importante patógeno de transmisión alimentaria en muchos países 1,2. La incidencia de la infección por Vibrio en los EE.UU. ha mostrado una tendencia al alza desde el año 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus es la especie más frecuentemente reportado que causan enfermedades en los EE.UU. 4,5. Otras especies clínicamente relevantes incluyen V. Alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un pequeño porcentaje de las enfermedades es causada por múltiples especies simultáneamente.
V. parahaemolyticus es una i naturalesnhabitant de agua marina y, por tanto, ampliamente distribuido en aguas marinas en todo el mundo, incluyendo los estuarios. La especie fue descubierta en 1950 después de un brote de intoxicación alimentaria en Japón. En los EE.UU., la especie fue aislada por primera vez en el agua de mar, sedimentos y moluscos en la región de Puget Sound 6,7. Filtradores en los hábitats marinos, como los moluscos bivalvos, pueden albergar V. parahaemolyticus como parte de su flora natural 8. Como tal, V. infecciones parahaemolyticus en humanos a menudo están relacionados con el consumo de mariscos contaminados, especialmente los mariscos crudos o poco cocidos. Una ruta menos común de entrada se produce cuando herida abierta se expone al agua del mar, lo que lleva a una infección cutánea. La mayoría V. cepas parahaemolyticus no causan enfermedad en humanos, sin embargo, ciertos subtipos que albergan los factores de virulencia como hemolisina directa termoestable (TDH) son patógenas. Los síntomas más frecuentes de transmisión alimentaria V. infección son parahaemolyticusdiarrea y dolor abdominal, seguido de náuseas, vómitos y fiebre. También se informa de dolor de cabeza y escalofríos. El período de incubación promedio es de 15 horas, pero puede ser de hasta 96 horas después del consumo de una cantidad suficiente de cepas patógenas 9. La enfermedad dura de dos a tres días. Los síntomas de la gastroenteritis causada por V. parahaemolyticus son en gran medida auto-limitante y, por tanto, un tratamiento especial no es necesario. Los casos leves de gastroenteritis pueden ser tratados eficazmente mediante rehidratación oral. Más enfermedades graves se pueden tratar con antibióticos tales como la tetraciclina o la ciprofloxacina 10. La tasa de mortalidad es de alrededor del 2% de los casos de gastroenteritis, pero puede ser tan alta como 29% para aquellos que desarrollan infección del torrente sanguíneo o septicemia. Cualquier persona que consume mariscos o tiene una herida abierta expuesta al agua de mar está en riesgo de V. infección parahaemolyticus. La forma más grave de enfermedades, septicemia que amenaza la vida, es más común en una subpoblación con co médico subyacentenditions 11, que incluyen el alcoholismo, enfermedad hepática, diabetes, enfermedad renal, enfermedad maligna, y otras condiciones que conducen a una respuesta inmune debilitado. Cabe destacar que este grupo de personas es también un riesgo mayor de contraer enfermedades graves causadas por V. vulnificus, que se puede encontrar en los hábitats naturales similares a V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus se aísla de forma rutinaria usando agar sales de sacarosa tiosulfato-citrato-biliares (TCBS) como un medio selectivo y diferencial. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina puede preceder el aislamiento en agar TCBS. presuntas colonias en TCBS se prueban aún más en una serie de pruebas bioquímicas y / o ensayos moleculares dirigidas a la presencia de genes específicos de cada especie. Métodos basados en PCR se utilizan a menudo para confirmar la identidad de V. parahaemolyticus mediante la amplificación del gen de la hemolisina termolábil, tlh 12.
Independientemente de la choice de los métodos de confirmación, es importante tener un medio eficaz para aislar y diferenciar V. parahaemolyticus de otros vibrios marinos en el primer lugar. TCBS rutinariamente se ha utilizado para diferenciar las especies dentro del género Vibrio, según su capacidad para fermentar la sacarosa 12. Reacción de fermentación positiva se acompaña de un cambio de color del indicador de pH de bromotimol azul. V. colonias parahaemolyticus son bastante distintiva en TCBS, exhibiendo color de azul a verde. Sin embargo, este medio no puede diferenciar fácilmente V. alginolyticus y V. cholerae. especies de Proteus sacarosa-fermentación pueden producir colonias de color amarillo que se asemejan V. V. cholerae o Alginolyticus 13. El aislamiento inicial en TCBS, V. parahaemolyticus también se han identificado erróneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, y Pseudomonas spp 14. Las cepas con ferm sacarosa retardadaentación puede ser confundida con otra sacarosa no fermentadores Vibrio 13, que incluye V. parahaemolyticus. TCBS se encontró que no es sensible frente a Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre otros. Varias otras especies producen colonias verdes a grises que son potencialmente confundirse con V. V. parahaemolyticus o 15 vulnificus. Como resultado de ello, es deseable desarrollar medios de cultivo alternativa con mejor sensibilidad y especificidad hacia la detección y el aislamiento de V. parahaemolyticus y otras especies estrechamente relacionadas.
Varias alternativas de medios de comunicación se han desarrollado recientemente. Además de la inclusión de agentes selectivos, la mayoría incorporan sustratos cromogénicos para diferenciar especies en base a sus actividades enzimáticas diferenciales. Por ejemplo, indoxilo-β-glucósido y de indoxilo-β-galactósido se han utilizado como los sustratos cromogénicos para diferenciar V. paracahaemolyticus colonias (que aparecen de color verde azulado) de las de V. cholerae (púrpura) debido a sus capacidades diferenciales para producir β-glucosidasa y β-galactosidasa 16. Diferentes formulaciones de agar cromogénico desarrolladas por varios grupos han sido evaluados y se informó para llevar a cabo de forma comparable a o mejor que TCBS 17,18,19. Una ventaja de usar un medio cromogénico es que la coloración del medio circundante es mínimo lo que facilita el aislamiento de colonias particulares. En este estudio, se evaluó la capacidad de un medio cromogénico de nueva formulación para detectar y aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus; con un enfoque especial en su capacidad para diferenciar V. parahaemolyticus de otras especies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio se centra en el desarrollo de medios de cultivo y evaluación. Convencionalmente, el TCBS es selectivo y diferencial medio utilizado para el aislamiento y la detección de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. 12 vulnificus. Sin embargo, se ha informado de limitaciones para este medio, tales como la incapacidad para diferenciar V. cholerae de otras especies de Vibrio. La sacarosa y el indicador de pH son los agentes de diferenciación de TCBS. Por lo t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a M. Channey, E. Chau, y K. Tomas por su colaboración en el proyecto. El Proyecto de abastecimiento fueron financiados parcialmente por California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
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