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Bioengineering

एकाधिक लंबाई तराजू पर प्रतिक्रियाशील बाहर निकालना, Microfluidics, स्व-विधानसभा, और Electrospinning के माध्यम से एक अपमानजनक Thermoresponsive Hydrogels बनाना

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/54502
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, McMaster University

Summary

प्रोटोकॉल hydrazone पार-थोक स्केल, अतिसूक्ष्म, और नेनो, दोनों जेल नैनोकणों और nanofibers की तैयारी के लिए बाद पर पॉलिमर oligomers के आधार पर आधारित क्षरण thermoresponsive hydrogels के निर्माण के लिए वर्णित हैं ।

Abstract

जबकि विभिन्न स्मार्ट सामग्री जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए पता लगाया गया है (उदा, दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, जैव इमेजिंग, आदि), उनके अंतिम नैदानिक उपयोग जैविक रूप से प्रासंगिक की कमी से प्रभावित किया गया है गिरावट सबसे स्मार्ट सामग्री के लिए मनाया । यह तापमान उत्तरदायी hydrogels के लिए विशेष रूप से सच है, जो लगभग समान रूप से बहुलक पर आधारित हैं जो कार्यात्मक रूप से गैर-ह्रासीय हैं (उदा, पाली (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) या पाली (oligoethylene ग्लाइकोल methacrylate) (POEGMA) ). जैसे, को प्रभावी ढंग से दूरस्थ नियंत्रित या चयापचय की चुनौतियों के लिए thermoresponsive hydrogels की क्षमता का अनुवाद-विनियमित दवा वितरण, स्वरित्र सेल के साथ सेल पाड़ सामग्री बातचीत, क्षमता के साथ theranostic सामग्री दोनों इमेजिंग और नशीली दवाओं के वितरण के लिए, और अंय ऐसे अनुप्रयोगों, एक विधि hydrogels रेंडर करने के लिए आवश्यक है (यदि पूरी तरह से सड़ नहीं) सामग्री की आवश्यक जीवनकाल निंनलिखित गुर्दे की मंजूरी के कम से सक्षम । कि अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड के बीच प्रतिक्रिया के आधार पर एकाधिक लंबाई तराजू पर hydrolytically सड़ hydrazone-crosslinked hydrogels की तैयारी का वर्णन-कार्यात्मक PNIPAM या आणविक के साथ POEGMA oligomers गुर्दे निस्पंदन सीमा के नीचे वजन । विशेष रूप से, तरीके सड़ thermoresponsive थोक hydrogels बनाने के लिए (एक डबल बैरल सिरिंज तकनीक का उपयोग), hydrogel कणों (एक microfluidics मंच के उपयोग के माध्यम से दोनों अतिसूक्ष्म पर एक साथ मिश्रण की सुविधा और emulsification और hydrogel nanofibers (एक प्रतिक्रियाशील electrospinning कार्यनीति का प्रयोग करते हुए) के प्रणेता पॉलिमर और नेनो के प्रयोग के माध्यम से एक थर्मल चालित स्व-विधानसभा और परस्पर जोड़ने की विधि का वर्णन किया गया है । प्रत्येक मामले में, तापमान के साथ hydrogels-उत्तरदायी उन पारंपरिक मुक्त कट्टरपंथी पार से जोड़ने प्रक्रियाओं के माध्यम से प्राप्त करने के लिए इसी तरह के गुण प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन hydrazone पार से जुड़े नेटवर्क के लिए समय पर नीचा किया जा सकता है oligomeric फिर से फार्म पूर्ववर्ती पॉलिमर और क्लीयरेंस सक्षम करें । जैसे, हम इन तरीकों की आशा (जो सामांय रूप से किसी भी सिंथेटिक पानी में घुलनशील बहुलक, नहीं सिर्फ स्मार्ट सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है) नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए सिंथेटिक स्मार्ट सामग्री का आसान अनुवाद सक्षम हो जाएगा ।

Introduction

स्मार्ट सामग्री महत्वपूर्ण पर प्रतिवर्ती के लिए अपनी क्षमता की वजह से ध्यान आकर्षित किया है "पर मांग" प्रतिक्रियाओं को बाहरी और/ तापमान-उत्तरदायी सामग्री विशेष रुचि उनके कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) व्यवहार के कारण आकर्षित किया है, तापमान टी > LCST1,2पर ताप चालित वर्षा में जिसके परिणामस्वरूप. thermoresponsive hydrogels के संदर्भ में, इस निचले महत्वपूर्ण समाधान तापमान व्यवहार प्रतिवर्ती सूजन द्वारा प्रकट होता है/de-सूजन घटनाओं है कि तापमान-स्वरित्र थोक आकारों में परिणाम (टी < LCST में बड़ा)3, ताकना आकार (टी में बड़ा < LCST)4, और चेहरे के गुण (अधिक हाइड्रोफिलिक पर T < LCST)5। इस तरह के संक्रमण व्यापक रूप से दवा वितरण में लागू किया गया है (बाहरी या पर्यावरण के लिए ट्रिगर करने वाली दवा रिलीज4,6,7), ऊतक इंजीनियरिंग और सेल संस्कृति (thermoreversible सेल आसंजन के लिए/ फाड़ना8,9,10), जुदाई (स्विच झिल्ली porosities और permeabilities या थर्मल के लिए-õ निदान का समर्थन करता है11,12, 13), microfluidic प्रक्रियाओं (के लिए पर बंद वाल्व को विनियमित प्रवाह14,15), और rheological संशोधक (तापमान के लिए-स्वरित्र viscosities16) । सबसे अधिक खोजी thermoresponsive hydrogels पॉली (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17पर आधारित हैं, हालांकि पाली (oligoethylene ग्लाइकोल methacrylate) (POEGMA) 2 पर महत्वपूर्ण (और बढ़ते हुए) कार्य भी आयोजित किए गए हैं ,18 और पाली (vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA विशेष हाल ही में अपने प्रत्याशित सुधार21,22और उसके सतही-धुन LCST व्यवहार है, जो में रैखिक-के विभिन्न नंबरों के साथ मोनोमर के पूर्वानुमानित मिश्रण को देखते हुए ब्याज आकर्षित किया है ईथीलीन ऑक्साइड उनके पक्ष जंजीरों में दोहराने इकाइयों ~ 20 ° c करने के लिए > 90 ° c2,23से LCST बदल सकते हैं । हालांकि, इन पॉलिमर के प्रत्येक मुक्त कट्टरपंथी बहुलकीकरण द्वारा तैयार किया जाता है और इस प्रकार एक कार्बन-कार्बन रीढ़ की है, काफी संभावित उपयोगिता और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के संदर्भ में ऐसे पॉलिमर के अनुवाद सीमित है जिसमें गिरावट (या गुर्दे छानने का समय के माध्यम से निकासी के लिए क्षमता से कम) आम तौर पर एक आवश्यकता है ।

इस सीमा के जवाब में, हम हाल ही में hydrazone रसायन विज्ञान के आवेदन पर बड़े पैमाने पर सूचना दी है (यानी, हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड के बीच प्रतिक्रिया कार्यात्मक पूर्व पॉलिमर) thermoresponsive के क्षरण योग्य एनालॉग तैयार करने के लिए hydrogels24,25,26,27,28,29. कार्यात्मक पूर्ववर्ती पॉलिमर के मिश्रण पर हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड समूहों के बीच तेजी से और प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया30 सीटू जमाना में सक्षम बनाता है (शल्य चिकित्सा के लिए की आवश्यकता के बिना इन सामग्रियों के सतही इंजेक्शन को सक्षम करने आरोपण या ऐसे यूवी विकिरण या रासायनिक दीक्षा के रूप में बाहरी बहुलकीकरण उत्तेजना के किसी भी प्रकार के रूप में अच्छी तरह से एक रसायन विज्ञान और crosslinking साइटों के घनत्व द्वारा नियंत्रित दर पर नेटवर्क के hydrolytic क्षरण । इसके अलावा, पूर्व के आणविक वजन को बनाए रखने के द्वारा गुर्दे निस्पंदन सीमा के नीचे hydrogels तैयार करने के लिए इस्तेमाल पॉलिमर, hydrogels इस दृष्टिकोण का उपयोग कर बनाया oligomeric अग्रदूत पॉलिमर कि शरीर से साफ किया जा सकता है में वापस नीचा25 ,27,28. कम cytotoxicity और कम भड़काऊ ऊतक इन सामग्रियों25,26,27द्वारा प्रेरित प्रतिक्रिया के साथ युग्मित, इस दृष्टिकोण thermoresponsive के उपयोग के लिए एक संभावित अनुवाद विधि प्रदान करता है स्मार्ट hydrogels चिकित्सा में, विशेष रूप से यदि सभी लंबाई तराजू पर इस तरह के hydrogels की अच्छी तरह से नियंत्रित क्षरण एनालॉग (थोक, माइक्रो, और नैनो) गढ़े जा सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में, हम सिंथेटिक thermoresponsive पूर्व पॉलिमर हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड समूहों की नियंत्रित संख्या के साथ कार्यात्मक बनाने के लिए तरीकों का वर्णन के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन पॉलिमर पर अच्छी तरह से परिभाषित आयामों के साथ hydrogels बनाने के लिए लागू करने के लिए विभिंन लंबाई तराजू । विशेष रूप से, इस पांडुलिपि चार अलग दृष्टिकोण हम प्रतिक्रियाशील हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड-कार्यात्मक पूर्व पॉलिमर के मिश्रण को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया है और इस तरह अच्छी तरह से परिभाषित geometries के साथ thermoresponsive hydrogel नेटवर्क बनाने का वर्णन और morphologies:

निर्धारित आकार, एक templating रणनीति है जिसके द्वारा प्रतिक्रियाशील पूर्व पॉलिमर एक स्थिर मिक्सर के साथ अपनी दुकान पर सुसज्जित एक डबल बैरल सिरिंज के अलग बैरल में लोड कर रहे हैं और बाद में सह एक में बाहर निकाले के साथ बनाया गया है के साथ अपमानजनक थोक hydrogels बनाने के लिए वांछित hydrogel आकार और आयामों के साथ सिलिकॉन मोल्ड21,27 (चित्रा 1) ।

Figure 1
चित्र 1 : थोक hydrogel गठन की योजनाबद्ध । हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड-कार्यात्मक बहुलक समाधान (पानी या जलीय बफर में) एक डबल बैरल सिरिंज के अलग बैरल में लोड कर रहे है और फिर सह एक बेलनाकार सिलिकॉन मोल्ड में एक स्थिर मिक्सर के माध्यम से बाहर निकाला । रूपों मिश्रण पर सीटू जमाना में तेजी से एक hydrazone crosslinked hydrogel, जो मुक्त खड़ा है (एक बार मोल्ड हटा दिया जाता है) मिनट के लिए सेकंड के भीतर एकाग्रता और कार्यात्मक समूह के घनत्व के प्रणेता पॉलिमर के आधार पर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

माइक्रोन-स्केल पर क्षरण जेल कणों बनाने के लिए, एक प्रतिक्रियाशील microfluidics विधि वर्णन किया गया है जिसमें प्रणेता बहुलक समाधान एक साथ मिश्रित कर रहे हैं और एक नरम लिथोग्राफी-टेम्पलेट microfluidic चिप डिजाइन का उपयोग कर emulsified, सक्षम करने मिश्रित प्रतिक्रियाशील बहुलक बूंदों के गठन कि बाद में सीटू में जेल microparticles द्वारा टेंपलेट आकार के साथ जेल फार्म (चित्रा 2)31,३२।

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिक्रियाशील microfluidics के माध्यम से जेल microparticle गठन की योजनाबद्ध. (A, B) हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड-कार्यात्मक बहुलक समाधान (पानी या जलीय बफर में) अलग जलाशयों कि एक zig-मेढ़ी एक दबाव ढाल backflow को रोकने बनाने के लिए डिजाइन चैनलों की श्रृंखला में बहाव से जुड़े हुए है में सिरिंज पंप से खिलाया जाता है । पॉलिमर तो बस से पहले मिलाया जा रहा है आयल तेल दोनों पक्षों से बहने से बाल काटना (भी एक सिरिंज पंप से प्रेरित) और एक नोक के माध्यम से मजबूर, प्रवाह में जिसके परिणामस्वरूप-जलीय (बहुलक समाधान) एक सतत तेल के दौर में बूंदों का उत्पादन ध्यान केंद्रित (देखें (ख) नोक क्षेत्र और छोटी बूंद गठन की प्रक्रिया के एक उदाहरण के लिए) । एक अतिरिक्त दो आयल तेल की सुविधा देता नोजल के बाद तैनात करने के लिए और संग्रह चैनल में बूंदों को अलग करने के लिए लामिना प्रवाह से कण हटाने से पहले पूरा जमाना के लिए अनुमति देते हैं, जिसके बाद परिणामस्वरूप microparticulate जैल है एक चुंबकीय उभारा चोंच में एकत्र; (ग) नोक पर छोटी बूंद पीढ़ी प्रक्रिया की तस्वीर (ध्यान दें कि हयद्रज़ीदे बहुलक मिश्रण वर्णन करने के लिए नीले रंग के रूप में लेबल है)

नेनो पर अपमानजनक जेल कणों बनाने के लिए, एक थर्मल चालित प्रतिक्रियाशील स्वयं विधानसभा विधि वर्णित है जिसमें प्रतिक्रियाशील पूर्ववर्ती पॉलिमर में से एक का समाधान ("बीज" बहुलक) अपनी LCST के ऊपर गर्म करने के लिए एक स्थिर nanoaggregate फार्म का है बाद में पूरक प्रतिक्रियाशील अग्रदूत बहुलक ("crosslinking" बहुलक) के अलावा द्वारा crosslinked; परिणामस्वरूप hydrazone crosslinked nanogel एक आकार nanoaggregate (चित्रा 3)28द्वारा सीधे टेंपलेट है ।

Figure 3
चित्र 3 : थर्मल संचालित प्रतिक्रियाशील स्व-विधानसभा के माध्यम से nanogel गठन की योजनाबद्ध । (thermoresponsive) हयद्रज़ीदे कार्यात्मक बहुलक युक्त एक जलीय समाधान अपनी कम महत्वपूर्ण समाधान के तापमान के ऊपर एक स्थिर uncrosslinked nanoaggregate बनाने के लिए गर्म है । निंनलिखित, एक एल्डिहाइड कार्यात्मक बहुलक hydrazone बांड गठन के माध्यम nanoaggregate crosslink और इस तरह nanogel के नीचे ठंडा पर LCST कण को स्थिर करने के लिए जोड़ा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक प्रतिक्रियाशील electrospinning तकनीक बनाने के लिए, जिसमें एक डबल बैरल सिरिंज इसके आउटलेट पर एक स्थैतिक मिक्सर के साथ सुसज्जित (के रूप में थोक hydrogels बनाने के लिए इस्तेमाल किया) एक मानक electrospinning मंच से जुड़ा हुआ है (चित्रा 4 )३३.

Figure 4
चित्र 4 : योजनाबद्ध hydrogel nanofiber गठन के बनाइएको प्रतिक्रियाशील electrospinning. एक डबल बैरल एक स्थैतिक मिक्सर के साथ सिरिंज (थोक hydrogels के लिए वर्णित के रूप में, लेकिन यह भी एक electrospinning सहायता के रूप में उच्च आणविक वजन पाली (ईथीलीन ऑक्साइड) का एक अंश सहित भरी हुई) एक सिरिंज पंप पर मुहिम शुरू की है, के अंत में सुई के साथ जुड़ा एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति करने के लिए । Hydrazone crosslinking फाइबर कताई प्रक्रिया के दौरान होता है ताकि जब धारा कलेक्टर हिट (या तो एल्यूमीनियम पंनी या एक घूर्णन एल्यूमीनियम डिस्क) nanofibrous आकृति विज्ञान बनाए रखा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस तरह के प्रयोग के लिए इस प्रकार के तरीकों का उपयोग किया जा रहा है कि इस प्रोटोकॉल में या तो PNIPAM या POEGMA के रूप में रुचि का बहुलक hydrogel; हालांकि, मूल दृष्टिकोण का वर्णन किया जा सकता है किसी भी पानी में घुलनशील बहुलक, चिपचिपापन के लिए उपयुक्त समायोजन के साथ हालांकि और (स्वयं के मामले विधानसभा nanogel निर्माण विधि) पूर्व की स्थिरता के बीज बनाने में बहुलक nanoaggregate ।

Protocol

1. हयद्रज़ीदे-कार्यात्मक पॉलिमर का संश्लेषण

नोट: निम्नलिखित विशिष्ट नुस्खा के लिए प्रदान की जाती है PNIPAM-mimetic thermoresponsive POEGMA के प्रणेता बहुलक (PO10) के साथ 30 मॉल% हयद्रज़ीदे functionalization । PNIPAM और POEGMA अलग चरण संक्रमण तापमान के साथ अग्रदूत पॉलिमर इस एक ही सामान्य विधि का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है, लेकिन प्रकार और कोर मोनोमर के अनुपात को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया (विभिन्न POEGMA पॉलिमर के लिए संशोधनों के लिए खंड १.२ देखें)21 , 25 , 27.

  1. वजन से ३७ मिलीग्राम 2, 2 '-azobis (2-methylpropionate) (AIBMe, फलत), ३.१ के g लए diethylene ग्लाइकोल methacrylate (M (एओ)2मा), ०.९ g के oligoethyleneglycol methacrylate (OEGMA४७५, ४७५ g/मॉल n = 7-8 ईथीलीन ऑक्साइड दोहराव इकाइयां), ५२३ µ l के एक्रिलिक एसिड (ए. ए., comonomer), और ७.५ µ एल के thiolglycolic एसिड (TGA, चेन स्थानांतरण एजेंट) में एक 20 मिलीलीटर ग्लास जुटाना शीशी ।
  2. पीओ0 के लिए (कमरे के तापमान संक्रमण तापमान POEGMA), का उपयोग करें ४.० जी का (ईओ)2एमए (कोई OEGMA४७५) । पीओ१०० (कोई संक्रमण तापमान POEGMA) के लिए, का उपयोग ४.० g of OEGMA४७५ (कोई एम (ईओ)2MA) ।
    नोट: मध्यवर्ती चरण संक्रमण तापमान एम (ईओ) के मध्यवर्ती मिश्रण के उपयोग के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है2MA और OEGMA४७५, Lutz एट अल के अनुसार । 23
  3. एक या एक से अधिक गर्दन के साथ एक गोल नीचे कुप्पी में dioxane (5 मिलीलीटर/जी कुल मोनोमर) में सभी reagents भंग ।
  4. 30 मिनट के लिए नाइट्रोजन (UHP ग्रेड) प्रवाह के साथ प्रतिक्रिया पर्ज ।
  5. एक बार जब पर्ज, एक पूर्व में गर्म तेल स्नान ७५ डिग्री सेल्सियस के लिए नाइट्रोजन और ४०० rpm चुंबकीय सरगर्मी के तहत 4 एच के लिए बनाए रखा में कुप्पी जगह ।
  6. 4 एच के बाद, विलायक ५० डिग्री सेल्सियस और २०० rpm के लिए सेट एक रोटरी वाष्पन का उपयोग कर हटा दें ।
  7. जल के १५० मिलीलीटर में परिणामी बहुलक उत्पाद भंग ।
  8. एक पांच में adipic एसिड dihydrizide (आढ) जोड़ें ए. ए. ए. ए. बहुलक में शामिल अवशेषों की संख्या के लिए अधिक दाढ़ अतिरिक्त (इस उदाहरण में, ए. ए. मोनोमर conductometric के अनुसार बहुलक में अनुमापन इकाइयों के 29 मॉल% शामिल हैं) ।
  9. ०.१ M HCl का उपयोग कर पीएच ४.७५ के लिए समाधान का पीएच समायोजित करें ।
  10. एक बार पीएच स्थिर हो गया है, जोड़ें n-(3-dimethylaminopropyl)-n'-ethylcarbodiimide (EDC) एक 5-गुना दाढ़ अतिरिक्त AA अवशेषों की संख्या के लिए मौजूद) ।
  11. 4 एच से अधिक ०.१ मीटर एचसीएल के dropwise अलावा के साथ प्रतिक्रिया पीएच ४.७५ बनाए रखें ।
  12. रात भर हलचल करने के लिए प्रतिक्रिया छोड़ दें ।
  13. तीन ~ 30 सेमी लंबी डायलिसिस ट्यूबों में उत्पाद समाधान डालो (३५०० दा आणविक वजन कट बंद, 1 इंच मोटाई), एक कीप का उपयोग कर छलकने को कम करने के लिए । ट्यूब के एक छोटे (~ 2 सेमी) खंड तह द्वारा भरने के लिए पहले एक चुटकी दबाना का उपयोग करने के लिए दबाना अखंडता में सुधार; शीर्ष पर दोहराएँ (हवा बुलबुले हटाने के लिए दबाव) जब भरने पूरा हो गया है. एक १०० के भीतर ट्यूबों प्लेस-पानी की अधिक मात्रा गुना और कम से 6 ज के लिए छोड़, पूरी तरह डायलिसिस के छह चक्र पर पानी की जगह के लिए वांछित पवित्रता प्राप्त ।
  14. Lyophilize dialyzed नमूना एक अंतिम सूख बहुलक उत्पाद प्राप्त करने के लिए ।

2. एल्डिहाइड-कार्यात्मक पॉलिमर का संश्लेषण

  1. एल्डिहाइड का संश्लेषण-प्रणेता मोनोमर एन-(२, २-Dimethoxyethyl) Methacrylate (DMEMA)
    1. एक ५०० मिलीलीटर 3 गर्दन दौर नीचे कुप्पी में एक 20% डब्ल्यू/वी NaOH समाधान के २०० मिलीलीटर प्लेस ।
    2. एक बर्फ स्नान में समाधान ठंडा और प्रतिक्रिया के दौरान बर्फ के साथ 0 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने ।
    3. इसमें ५० मिलीलीटर की aminoacetyl एल्डिहाइड dimethyl acetal का ठंडा NaOH घोल डालें ।
    4. टेम्पो के ०.१ ग्राम ((2, 2, 6, 6-Tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl में जोड़ें) और ४०० rpm पर हलचल का उपयोग कर एक चुंबकीय हलचल बार जब तक गति पूरी तरह से घुल ।
    5. 2 एच पर एक burette का उपयोग कर methacryloyl क्लोराइड dropwise की ४८ मिलीलीटर जोड़ें
    6. 2 एच के बाद, एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रतिक्रिया पोत कवर और रात भर हलचल छोड़ दें ।
    7. एक 1 एल जुदाई कीप में पेट्रोलियम ईथर के ७५ मिलीलीटर के लिए प्रतिक्रिया उत्पाद जोड़कर उत्पाद निकालें, मिलाते हुए, degassing, और शीर्ष परत त्याग ।
    8. दोहराएं चरण 2.1.7 तीन बार अगले निष्कर्षण चक्र के लिए कच्चे उत्पाद के रूप में प्रत्येक निष्कर्षण कदम से नीचे परत उत्पाद जोड़कर ।
    9. अंतिम तल परत उत्पाद निकालें और एक १०० मिलीलीटर चोंच में स्थानांतरण ।
    10. जोड़ें ~ 5 जी मैग्नीशियम सल्फेट (मिलीग्राम2तो4) मोनोमर के साथ चोंच जब तक एक "बर्फ ग्लोब प्रभाव" मनाया जाता है ।
    11. १०० मिलीलीटर Buchner कीप के माध्यम से फ़िल्टर मिलीग्राम2तो4को दूर करने के लिए ।
    12. tert-butyl मिथाइल ईथर के ~ ७५ मिलीलीटर के साथ दो बार चोंच कुल्ला, हर बार कीप के माध्यम से कुल्ला समाधान डालने ।
    13. एक ५०० मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी करने के लिए उत्पाद स्थानांतरण और अंतिम उत्पाद एकत्र करने के लिए कमरे के तापमान २०० RPM पर एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
  2. एल्डिहाइड-कार्यात्मक पॉलिमर का संश्लेषण
    नोट: निम्नलिखित विशिष्ट नुस्खा के लिए प्रदान की जाती है PNIPAM-mimetic POEGMA के प्रणेता बहुलक (PO10) के साथ 30 मॉल% एल्डिहाइड functionalization. PNIPAM और POEGMA विभिन्न चरण संक्रमण तापमान के साथ प्रणेता पॉलिमर एक ही सामान्य विधि का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है, लेकिन प्रकार और कोर मोनोमर के अनुपात में संशोधन करने के लिए इस्तेमाल किया (विभिन्न POEGMA पॉलिमर के लिए संशोधनों के लिए खंड १.२ देखें)21 , 25 , 27.
    1. वजन से ३७ मिलीग्राम 2, 2 '-azobis (2-methylpropionate) (AIBMe), ३.१० g च्या diethylene ग्लाइकोल methacrylate M (एओ)2मा, ०.१ g च्या oligo ethyleneglycol methacrylate (OEGMA४७५, ४७५ g/मोल, n = 7-8 ईथीलीन ऑक्साइड दोहराव इकाइयां), १.३० g of n-(2, 2- dimethoxyethyl) acrylamide (DMEMA) और ७.५ µ एल के thiolglycolic एसिड (TGA) में एक 20 मिलीलीटर ग्लास जुटाई शीशी ।
    2. पीओ0 के लिए (कमरे के तापमान संक्रमण तापमान POEGMA), का उपयोग करें ४.० जी का (ईओ)2एमए (कोई OEGMA४७५) । पीओ१०० (कोई संक्रमण तापमान POEGMA) के लिए, का उपयोग ४.० g of OEGMA४७५ (कोई एम (ईओ)2MA) ।
      नोट: मध्यवर्ती चरण संक्रमण तापमान एम (ईओ) के मध्यवर्ती मिश्रण के उपयोग के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है2MA और OEGMA४७५, Lutz एट अलके अनुसार । 23
    3. एक या एक से अधिक गर्दन के साथ एक गोल नीचे कुप्पी में dioxane (5 मिलीलीटर/जी कुल मोनोमर) में सभी reagents भंग ।
    4. 30 मिनट के लिए नाइट्रोजन (UHP ग्रेड) प्रवाह के साथ प्रतिक्रिया पर्ज ।
    5. एक बार जब पर्ज, एक पूर्व गरम तेल स्नान में जगह कुप्पी के लिए ७५ ° c में 4 एच के तहत नाइट्रोजन और ४०० rpm चुंबकीय सरगर्मी बनाए रखा ।
    6. 4 एच के बाद, विलायक ५० डिग्री सेल्सियस और २०० rpm के लिए सेट एक रोटरी वाष्पन का उपयोग कर हटा दें ।
    7. १०० मिलीलीटर में परिणामी बहुलक उत्पाद भंग एच2O ।
    8. भंग समाधान में 1 मीटर एचसीएल के ५० मिलीलीटर जोड़ें और DMEMA में acetal कार्यक्षमताओं को पूरी तरह से hydrolyze के लिए 24 घंटे के लिए चुंबकीय सरगर्मी (४०० RPM) के तहत हलचल ।
    9. प्रतिक्रिया पूरा होने के बाद, डायलिसिस टयूबिंग में बहुलक समाधान स्थानांतरण, १.१३ कदम के अनुसार ।
    10. Lyophilize dialyzed नमूना एक अंतिम सूख बहुलक उत्पाद प्राप्त करने के लिए ।

3. Hydrazone Crosslinked बल्क Hydrogels का निर्माण

  1. भंग हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड कार्यात्मक पॉलिमर में अलग से 10 मिमी फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब), या किसी भी वांछित जलीय बफर, वांछित सांद्रता के समाधान बनाने के लिए.
    नोट: 5-40 wt% के बीच सामूहिक सांद्रता आम तौर पर उपयोग किया जाता है, कम सांद्रता पर जमाना के साथ यदि उच्च कार्यात्मक समूह भिंन पॉलिमर पर मौजूद हैं ।
  2. समाधान हस्तांतरण करने के लिए एक एकल बैरल सिरिंज का उपयोग करना, एक डबल बैरल सिरिंज (२.५ मिलीलीटर की मात्रा, 1:1 अनुपात सिरिंज) एक स्थिर मिक्सर से जुड़ी (१.५ "लंबाई) और (वैकल्पिक) एक सिरिंज (आम तौर पर 18 ग्राम) के अलग बैरल में प्रत्येक प्रणेता समाधान (~ 1 मिलीलीटर प्रत्येक) लोड १.५ "में इन विट्रो अध्ययन के लिए लंबाई) और (वैकल्पिक) एक सिरिंज (आमतौर पर 18 जी, १.५" इन विट्रो के अध्ययन के लिए लंबाई).
  3. एक सिलिकॉन रबर शीट में छेद छिद्रण द्वारा वांछित मोटाई, आकार, और व्यास के मोल्ड तैयार करते हैं ।
    नोट: एक ठेठ प्रयोग में, एक मानक पंच सेट एक 1/16 "मोटी सिलिकॉन रबर शीट (जलाशय की कुल मात्रा ~ ३०० µ एल) के अंदर एक 7 मिमी व्यास बेलनाकार छेद पंच करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  4. एक मानक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सिलिकॉन मोल्ड माउंट ऐसे है कि मोल्ड में छिद्रित छेद पूरी तरह से कांच द्वारा समर्थित हैं ।  कांच की एक ०.१ मीटर एचसीएल धोने की सिफारिश की लेकिन सिलिकॉन मोल्ड के बढ़ते से पहले की आवश्यकता नहीं है ।
  5. सीओ डबल बैरल सिरिंज स्थैतिक मिक्सर के माध्यम से सामग्री को पूरी तरह से भरने के लिए बाहर निकालना (या थोड़ा भर में, शीर्ष पर एक meniscus के साथ) सिलिकॉन मोल्ड ।
    नोट: एकाधिक नमूने एक बाहर निकालना नमूने के दौरान तैयार किया जा सकता है जमाना समय परिमाण के एक ही आदेश पर है या कुल समय एकाधिक molds भरने की आवश्यकता से अधिक है प्रदान की ।
  6. मोल्ड के शीर्ष पर एक और मानक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस और जमाना के लिए पूरा करने के लिए प्रतीक्षा करें ।
    नोट: < 1 मिनट के भीतर संश्लेषण अनुभाग जेल में वर्णित मानक व्यंजनों; धीमी जमाना बार (और इस प्रकार अब प्रतीक्षा समय की आवश्यकता) कम कार्यात्मक समूह घनत्व, कम बहुलक सांद्रता और/या OEGMA४७५ के सापेक्ष मीटर (ईओ)2एमए (POEGMA hydrogels के लिए) के लिए उच्च भागों में मनाया जाता है ।
  7. शीर्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड निकालें और सिलिकॉन रबर मोल्ड से दूर hydrogel पुश करने के लिए एक रंग का उपयोग करें ।
  8. आगे परीक्षण के लिए hydrogels ठीक करने के लिए कम माइक्रोस्कोप स्लाइड से मोल्ड लिफ्ट ।

4. Hydrazone Crosslinked जेल Microparticles का निर्माण

  1. Microfluidic चिप का निर्माण
    1. निर्जलीकरण एक सिलिकॉन वेफर (डी = ७६.२ mm, ३८० µm मोटाई, पी मैगनीज, < 100 > अभिविंयास) पर हीटिंग द्वारा एक चूल्हा पर २०० ° c 5 मिनट के लिए ।
    2. केंद्र एक स्पिन कोट और कोट पर वेफर ~ १०० su की µm मोटी परत-८ १०० लागू करके ~ एसयू के 7 मिलीलीटर-8 विरोध, ५०० rpm/एस की दर पर स्पिन ३००० rpm को गति रैंप, और फिर 30 सेकंड के लिए ३००० rpm पर गति पकड़ ।
    3. पूर्व ६५ ° c पर 10 मिनट के लिए कोटिंग सेंकना और फिर नरम-30 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर कोटिंग सेंकना ।
    4. आरेख 2aद्वारा निर्धारित microfluidic प्रतिमान के साथ पारदर्शिता पर एक photomask मुद्रित करें, जैसे कि पारदर्शी अनुभाग बहुलक किए गए photoresist परत के वांछित प्रतिमान हैं ।
    5. डालें photoresist-लेपित सिलिकॉन वेफर और photomask एक मुखौटा संरेखण में और ९५ s (६.५ डब्ल्यू जोखिम शक्ति) के लिए ३६५ एनएम प्रकाश के लिए वेफर बेनकाब ।
    6. ९५ ° c पर 10 मिनट के लिए नमूनों वेफर सेंकना, यह ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर रखकर पहले और बाद में ९५ ° c के लिए चूल्हा हीटिंग पर 10 डिग्री सेल्सियस/
    7. चूल्हा से वेफर निकालें और एक ५०० मिलीलीटर चोंच में १०० मिलीलीटर एसयू-8 कम से 10 मिनट के लिए डेवलपर से युक्त, दूर करने के लिए गैर-उजागर photoresist को दूर करने के लिए भर में समाधान में वेफर धीरे घूमता । 10 मिनट के बाद, isopropanol और हवा के साथ शुष्क के साथ नमूनों वेफर कुल्ला । स्टोर एक शांत, शुष्क पर्यावरण प्रकाश से दूर जब नरम लिथोग्राफी प्रतिकृति ढलाई के लिए उपयोग में नहीं में नमूनों वेफर ।
    8. एक पेट्री डिश में patterned microfluidic मोल्ड प्लेस । स्थिति ~ 10 मिमी की लंबाई L/एस 13 सिलिकॉन टयूबिंग और चिप के आउटलेट पर ।
    9. डालो ~ पाली के 10 मिलीलीटर (dimethyl siloxane) (PDMS; एक 10:1 अनुपात में सिलिकॉन Elastomer बेस और सिलिकॉन Elastomer इलाज एजेंट मिश्रण द्वारा तैयार) चिप के शीर्ष पर, ध्यान से रखा सिलिकॉन टयूबिंग के भीतर किसी भी PDMS शामिल परहेज ।
    10. के लिए एक निर्वात चैंबर में पेट्री डिश प्लेस ~ 10 मिनट के लिए हवा में और इलाज के दौरान नमूनों की संरचना के आसपास कायम बुलबुले को दूर करने के लिए ।
    11. 2-3 एच के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर नमूनों मोल्ड और खरीदे PDMS युक्त पेट्री पकवान रखकर PDMS इलाज ।
    12. सावधानी से नमूनों सिलिकॉन वेफर से ठीक PDMS छील microfluidic मोल्ड के नरम lithographic नमूनों PDMS प्रतिकृति बेनकाब करने के लिए ।
    13. पैटर्न PDMS और एक गिलास स्लाइड उल्टा एक उच्च शक्ति प्लाज्मा क्लीनर में एक हवा फ़ीड के साथ रखें । २०० mTorr पर प्लाज्मा लागू करें और ९० एस के लिए ४५ डब्ल्यू ग्लास स्लाइड करने के लिए PDMS बांड और अंतिम microfluidic चिप बनाने के लिए ।
  2. जेल Microparticles का संश्लेषण
    1. NIPAM (4.5 ग्राम) को भंग करके हयद्रज़ीदे-कार्यात्मक PNIPAM (PNIPAM-Hzd) तैयार करें, ऐक्रेलिक एसिड (०.५ g-15 मॉल% कुल मोनोमर), thioglycolic एसिड (TGA, ८० µ एल), और 2, 2-azobisisobutyric एसिड dimethyl एस्टर (AIBME, ०.०५६ ग्राम) में निर्जल इथेनॉल के 20 मिलीलीटर और बाद में कदम 1.4-1.14 संश्लेषण को पूरा करने के बाद, हालांकि १.५ चरण में ५६ डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया तापमान बदल रहा है ।
    2. NIPAM (4 ग्राम) को भंग करके एल्डिहाइड-कार्यात्मक PNIPAM (PNIPAM-एलड) तैयार करें, एन-(2, 2-dimethoxyethyl) methacrylate (DMEMA, ०.९५ जी-१३.४ मॉल% कुल मोनोमर), thioglycolic एसिड (TGA, ८० µ एल), और 2, 2-azobisisobutyric एसिड dimethyl एस्टर (AIBME, ०.०५६ ग्राम) में 20 इथेनॉल के एमएल और बाद में कदम 2.2.4-2.2.10 संश्लेषण को पूरा करने के लिए, हालांकि चरण 2.2.5 में ५६ ° c करने के लिए प्रतिक्रिया तापमान बदल रहा है.
    3. भंग PNIPAM-Hzd और PNIPAM-एलड में 6 wt% पर पानी और अलग मानक 5 मिलीलीटर सीरिंज में लोड ।
    4. भंग 1 wt% ईओण surfactant (जैसे, स्पैन ८०) भारी आयल तेल में और एक मानक ६० मिलीलीटर सिरिंज में समाधान लोड ।
    5. दो अग्रदूत बहुलक समाधान सीरिंज microfluidic चिप पर दो अलग बहुलक प्रवेश चैनलों और microfluidic चिप पर तेल प्रवेश चैनल के लिए आयल तेल समाधान 1/32 के माध्यम से कनेक्ट "आईडी सिलिकॉन टयूबिंग (~ प्रवेश प्रति 30 सेमी लंबाई, ~ आउटलेट प्रति ४५ सेमी लंबाई) ।
    6. दो अलग अर्क सिरिंज पंपों का उपयोग (तेल ऊपर के लिए एक, तेल के लिए एक नोजल के बाद जोड़ा), चिप में एक प्रवाह की दर से १.१ मिलीलीटर/एच और ५.५ मिलीलीटर के बीच में तेल देने के लिए बहुलक प्रवाह शुरू करने के बिना प्रधानमंत्री चिप और यह सुनिश्चित चिप दोष मुक्त है और परिचालन (आमतौर पर एक 30 मिनट की अवधि में बनाए रखा) ।
    7. एक अलग अर्क सिरिंज पंप का प्रयोग, ०.०३ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर चिप के लिए जलीय बहुलक समाधान के प्रत्येक उद्धार/
    8. एक प्रारंभिक स्थिरीकरण अवधि के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवाह equilibrated है और समान कणों का गठन कर रहे हैं (30 मिनट-1 ज), एक चुंबकीय उभारा दौर नीचे कुप्पी में कणों को इकट्ठा.
    9. इकट्ठा कणों जब तक सभी तेल (12-55 ज, प्रवाह के आधार पर) भस्म हो जाता है । सिरिंज पंप बंद करो और, अगर वांछित, तुरंत साफ करने के लिए चिप के माध्यम से अग्रदूत बहुलक समाधान के स्थान पर पानी पंप ।  हालांकि, इन सामग्रियों की सीटू जमाना में तेजी को देखते हुए जब प्रवाह रोक दिया जाता है तो उसे प्रत्येक अलग प्रयोग के लिए एक नई चिप का इस्तेमाल करने की सिफारिश की जाती है ।
    10. चुंबकीय सरगर्मी बंद करें और जेल microparticles बसने के लिए अनुमति देते हैं । एक पिपेट का उपयोग कर सभी उपलब्ध आयल आयल बंद कर सकते हैं ।
    11. शेष आयल तेल को हटाने के लिए, पेंटेन के साथ जेल microparticles धो (microparticle मात्रा के हर ०.५ मिलीलीटर के लिए 10 मिलीलीटर की एक मात्रा में लागू), जोरदार ~ 1 मिनट के लिए पायस मिश्रण, जेल microparticles के लिए पुन: व्यवस्थित करने की अनुमति ~ 1-2 घंटे, और बंद नहीं अवशिष्ट कार्बनिक एक पिपेट का उपयोग चरण । पूर्ण आयल आयल हटाने को सुनिश्चित करने के लिए कम से 5 बार दोहराएं ।
    12. 10 मिलीलीटर पानी में एक 20 मिलीलीटर की शीशी के अंदर जेल microparticles reसस्पेंड और किसी भी अवशिष्ट पेंटेन को दूर करने के लिए रात भर नाइट्रोजन के साथ शीशी शुद्ध ।

5. Hydrazone Crosslinked Nanogels का निर्माण

  1. PNIPAM-Hzd (1 w/v%) और PNIPAM-एलड (1 w/v%) के स्टॉक समाधानों को भंग पानी में । क्रमशः वर्गों 4.2.1 और 4.2.2 में वर्णित PNIPAM-Hzd और PNIPAM-एलड तैयार करें.
  2. एक 20 मिलीलीटर ग्लास जुटाना शीशी अंदर चुंबकीय सरगर्मी (३५० RPM) के तहत एक तेल स्नान का उपयोग कर 70 ˚ सी के लिए PNIPAM-Hzd स्टॉक समाधान के एक 5 मिलीलीटर aliquot गर्मी ।
    नोट: समाधान अपारदर्शी हो जाना चाहिए (यानी तापमान PNIPAM-Hzd के निचले महत्वपूर्ण समाधान तापमान से अधिक है), लेकिन कोई दृश्यमान हाला का गठन किया जाना चाहिए ।
  3. PNIPAM-एलड के ०.२५ मिलीलीटर aliquot जोड़ें (5-20 बीज समाधान में PNIPAM-Hzd वर्तमान के द्रव्यमान का wt%) ड्रॉप वार 5-10 एस की अवधि में गरम PNIPAM-Hzd समाधान में ।
  4. एक अतिरिक्त 15 मिनट, जिसके बाद तेल स्नान से नमूना निकालने के लिए और उत्पाद रात के तापमान कमरे में ठंडा करने की अनुमति के लिए जुटाना शीशियों में समाधान मिश्रण जारी रखें ।
  5. Dialyze के परिणामस्वरूप nanogels से अधिक 6x6 घंटे के चक्र (एक ३५०० केडीए MWCO डायलिसिस झिल्ली का उपयोग) के खिलाफ किसी भी गैर crosslinked बहुलक हटाने के लिए पानी । यदि चाहें तो स्टोरेज के लिए lyophilize ।

6. Hydrazone Crosslinked Nanofibers का निर्माण

  1. तैयार हयद्रज़ीदे-कार्यात्मक POEGMA (POEGMA-Hzd) भंग करके ३७ मिलीग्राम dimethyl 2, 2 '-azobis (2-methylpropionate) (AIBMe), ४.० g oligoethyleneglycol methacrylate (OEGMA४७५, ४७५ g/मोल, n = 7-8 ईथीलीन ऑक्साइड दोहराने इकाइयों), और ०.२५ ग्राम एक्रिलिक एसिड (एए) में 20 मिलीलीटर dioxane और कदम के बाद 1.3-1.14 संश्लेषण को पूरा करने के लिए ।
  2. तैयार एल्डिहाइड-कार्यात्मक POEGMA (POEGMA-एलड) भंग करके ५० मिलीग्राम dimethyl 2, 2 '-azobis (2-methylpropionate) (AIBMe), ४.० g oligoethyleneglycol methacrylate (OEGMA४७५, ४७५ g/मोल, n = 7-8 ईथीलीन ऑक्साइड दोहराव इकाइयां), और ०.६० g n-(2, 2- dimethoxyethyl) methacrylate (DMEMA) में २० मिलीलीटर dioxane और निम्न चरणों में 2.2.3-2.2.10 का संश्लेषण पूर्ण करना.
  3. भंग POEGMA-Hzd (15 wt%) और POEGMA-एलड (15 wt%) में पृथक से जल समाधान ।
  4. पाली (ईथीलीन ऑक्साइड) भंग (पेो, Mw= 600x103 g/मोल, जल में 5 wt%) ।  ७.५ wt% POEGMA प्रणेता बहुलक और २.५ wt% पेो के अंतिम प्रणेता समाधान बनाने के लिए चरण ६.३ में तैयार प्रत्येक प्रतिक्रियाशील POEGMA समाधान के साथ पेो समाधान की 1 मिलीलीटर मिलाएं ।
  5. एक ही डबल बैरल 3 खंड में वर्णित सिरिंज के अलग बैरल में दो समाधान लोड (भी १.५ "स्थैतिक मिक्सर सहित) और माउंट डबल बैरल एक अर्क सिरिंज पंप पर सिरिंज ।
  6. डबल बैरल सिरिंज के लिए एक स्थिर मिक्सर और एक कुंद-टिप 18G सुई देते हैं ।
  7. एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति कुंद टिप सुई, कलेक्टर में जमीन के लिए कनेक्ट करें ।
    नोट: लेनेवालों या तो एक 10 मिमी x 10 एल्यूमीनियम पन्नी या एक ~ 10 मिमी व्यास एल्यूमीनियम डिस्क २०० rpm की दर से स्पिनिंग, दोनों एक सुई के अंत से 10 सेमी की दूरी पर खड़ा सुई के लिए घुड़सवार के वर्ग से मिलकर बनता है ।
  8. ०.४८ मिलीलीटर/एच की दर से सिरिंज पंप शुरू और एक साथ, electrospinning प्रदर्शन और nanofibers बनाने के लिए ८.५ केवी की एक उच्च वोल्टेज पर स्विच ।
  9. जारी electrospinning के रूप में विभिंन मोटाई के पाड़ बनाने के लिए या जब तक प्रवेश समाधान थक रहे है वांछित ।
  10. पेो electrospinning सहायता को दूर करने के लिए, एकत्र पाड़ों को 24 घंटे के लिए पानी में भिगो दें ।

Representative Results

थोक hydrogels एक सिलिकॉन मोल्ड में एक डबल बैरल सिरिंज से बाहर निकाला मोल्ड के आयामों के अनुरूप है और मुक्त हो मोल्ड हटाने पर खड़े; जमाना आम तौर पर इस्तेमाल किया बहुलक अग्रदूतों के आधार पर सह बाहर निकालना निंनलिखित मिनट के लिए सेकंड होता है । सूजन के द्वारा ठेठ लक्षण वर्णन (मापा gravimetrically एक कोशिका संस्कृति डालने का उपयोग करने के लिए आसानी से सूजन समाधान से hydrogel दूर), thermoresponsivity (एक ही तकनीक का उपयोग कर मापा लेकिन ऊपर की मशीन तापमान साइकल चलाना और चरण संक्रमण तापमान के नीचे), गिरावट (एक ही तकनीक का उपयोग कर मापा लेकिन अब समय अवधियों पर), और कतरनी या संपीड़न मापांक (2 मिमी मोटी और 7 मिमी व्यास ढाला नमूनों का उपयोग कर मापा जाता है) hydrogel के tunability को दर्शाता है उत्तर (विशेष रूप से, POEGMA के लिए, कम से लंबी श्रृंखला OEGMA मोनोमर के लिए hydrogel तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है) के प्रणेता बहुलक के रसायन विज्ञान पर निर्भर करता है, अग्रदूत पॉलिमर पर कार्यात्मक समूहों के तिल अंश, और उन की एकाग्रता प्रणेता पॉलिमर (चित्रा 5)27.

Microfluidics 25-100 µm के आकार पैमाने पर अच्छी तरह से परिभाषित जेल microparticles के गठन की ओर जाता है, तेल और के प्रवाह की दर के आधार पर नियंत्रणीय आकार के साथ/या संयुक्त जलीय बहुलक चरणों (चित्रा 6A)31। गर्म चरण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की पुष्टि करता है कि जेल microparticles थोक hydrogels के thermoresponsive प्रकृति को बनाए रखने, प्रतिवर्ती तापमान पर निर्भर सूजन दिखा 1 चक्र पर केवल एक मामूली हिस्टैरिसीस के साथ सूजन (के लिए पड़ोसी के बीच अपरिवर्तनीय हाइड्रोजन बांड गठन ध्वस्त राज्य में समूहों के बीच३४) कि थोक PNIPAM hydrogels (चित्रा घमण्ड)३२में मनाया के साथ संगत । इसके अलावा, जेल microparticles समय के साथ उनके oligomeric अग्रदूतों को वापस नीचा, गुर्दे की मंजूरी (चित्रा 6C)३२को सक्षम करने से ।

स्व-विधानसभा एक हयद्रज़ीदे के nanoaggregation द्वारा संचालित एक गरम समाधान में कार्यात्मक PNIPAM बहुलक एक एल्डिहाइड के साथ crosslinking द्वारा पीछा किया, अत्यधिक PNIPAM monodisperse में nanogels बहुलक परिणाम (polydispersity < 0.1) 180-300 एनएम की आकार सीमा, प्रक्रिया की स्थिति (चित्रा 7ए)28इस्तेमाल के आधार पर । nanogels पारंपरिक मुक्त कट्टरपंथी crosslinked PNIPAM nanogels के ठेठ thermoresponsive व्यवहार को बनाए रखने, थर्मल सूजन के कम डिग्री के साथ मनाया के रूप में अधिक पार से जोड़ने बहुलक जोड़ा गया था (चित्रा 7बी) । nanogels lyophilized जा सकता है और कण आकार में परिवर्तन (चित्रा 7सी) और hydrolysis के माध्यम से समय पर नीचा करने के लिए पुन: oligomeric अग्रदूत पॉलिमर nanogels (चित्रा 7डी) तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया फार्म के बिना reउड़कर ।

प्रतिक्रियाशील electrospinning एक nanofibrous hydrogel संरचना बनाता है (चित्रा 8ए), nanofiber व्यास के साथ ~ ३०० समुद्री मील दूर दिखाई electrosprayed कणों के बिना प्राप्त करने के क्रम पर३३उपस्थित । तेजी से जलयोजन में पानी के परिणामों में POEGMA आधारित nanofibers भिगोना (परिमाण के मोटे तौर पर दो आदेश तेजी से एक ही संरचना के एक थोक जेल के साथ प्राप्त की तुलना में, चित्रा 8बी), लेकिन 8-10 सप्ताह से अधिक nanofibrous आकृति विज्ञान का कहना है पहले शारीरिक स्थितियों में hydrolytic ह्रास; अम्ल-catalyzed वातावरण में तीव्र ह्रास मनाया जाता है, जैसा कि अपेक्षित अम्ल-catalyzed hydrazone बांड क्षरण (चित्रा ८सी) के लिए संभावित के कारण होता है. nanofibrous संरचनाओं भी कई चक्र से अधिक शुष्क और सूजन राज्यों दोनों में यांत्रिक रूप से मजबूत कर रहे हैं, आसान हैंडलिंग और दोहराव तनाव को सक्षम करने (चित्रा 8डी).

Figure 5
चित्र 5 : सीटू में गुण-बीच बढ़िया तालमेल बल्की ह्रास thermoresponsive hydrogels. (क) प्रतिनिधि POEGMA जेल नेटवर्क microstructures और थोक hydrogel के अग्रदूतों में OEGMA४७५ के एक समारोह के रूप में इसी जमाना बार के साथ इस तरह के एक कार्य के रूप में शामिल हैं । (बी-सी) भंडारण मापांक पीओ१०० के hydrogels अलग से (ख) प्रणेता बहुलक एकाग्रता और (ग) तिल% कार्यात्मक समूह निगम के अग्रदूत के प्रति बहुलक; (डी एफ) OEGMA के एक समारोह के रूप में POEGMA hydrogels के Physiochemical गुण४७५ तिल% निगमन: (घ) भंडारण मापांक (ई) 1 एम एचसीएल में क्षरण प्रोफ़ाइल, और (एफ) रेंज 20-60 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान परिवर्तन के जवाब में खंड चरण संक्रमण तापमान । सभी त्रुटि पट्टियां n = 4 के मानक विचलन माप दोहराने का प्रतिनिधित्व करते हैं । Elsevier से अनुमति के साथ संदर्भ27 से अनुकूलित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : प्रतिक्रियाशील microfluidics से क्षरण जेल microparticles के गुण. (एक) तेल प्रवाह दर के पानी में (शुद्ध) जेल microparticle आकार पर प्रभाव; (ख) जल में शुद्ध जेल microparticles के Thermoresponsivity ऊपर और नीचे की मात्रा चरण संक्रमण तापमान एक एकल थर्मल चक्र के बाद; (ग) दृश्य मूल्यांकन (फोटो) और जेल permeation क्रोमैटोग्राफी निशान (ग्राफ) जेल के क्षरण की पुष्टि microparticles वापस उनके प्रणेता बहुलक घटकों (यहां, 1 एम एचसीएल में इमेजिंग के समय पैमाने पर त्वरित गिरावट की सुविधा के लिए); स्केल पट्टी = १०० µm. संदर्भ३२से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : प्रतिक्रियाशील स्व-विधानसभा से ह्रास nanogels के गुण. (एक) nanogels के कण आकार वितरण अलग एल्डिहाइड के साथ तैयार: गतिशील प्रकाश कैटरिंग से हयद्रज़ीदे बहुलक जन अनुपात (इनसेट: संचरण इलेक्ट्रॉन micrograph nanogels के गोलाकार प्रकृति की पुष्टि); (ख) एल्डिहाइड के बीच जन अनुपात के एक समारोह के रूप में स्वयं इकट्ठे कणों की Thermosensitivity: हयद्रज़ीदे बहुलक (गतिशील प्रकाश बिखरने से) nanogels तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया, त्रुटि सलाखों के साथ n = 4 के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने की प्रतिकृति; (ग) nanogel एकत्रीकरण के अभाव की दृश्य पुष्टि दोनों पूर्व और पश्चात lyophilization; (घ) nanogels के अम्ल-catalyzed क्षरण की दृश्यात्मक पुष्टि (यहाँ पर अन्य अध्ययनों के साथ संगति के लिए १ एम एचसीएल में); (ई) जेल nanogel गिरावट हयद्रज़ीदे और एल्डिहाइड के लिए अपनी समानता का संकेत उत्पादों के permeation chromatograph निशान-कार्यात्मक पूर्ववर्ती पॉलिमर । संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित28। कॉपीराइट २०१५, अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : प्रतिक्रियाशील electrospinning से ह्रास nanofibers के गुण. (क) शुष्क राज्य में nanofibers की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों (बाएँ), आधा पानी में डूबा हुआ (मध्यम, पतली फिल्म), और पूरी तरह से रात भर पानी में लथपथ (सही, मोटा पाड़); (ख) nanofibrous hydrogel की सूजन (लाल) एक थोक hydrogel के सापेक्ष (नीला) एक ही संरचना के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों के साथ, n = 4 प्रतिकृति; (ग) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और (इनसेट) दृश्य छवियाँ 1m एचसीएल में nanofibers के अम्ल-catalyzed क्षरण पर नज़र रखने; (घ) शुष्क (८० चक्र, 20% बढ़ाव/चक्र) और सूजन (३२५ चक्र, 10% बढ़ाव/electrospun nanofibrous hydrogels की तन्यता साइकिल चालन) । आंकड़ा संदर्भ से संशोधित३३ और रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हम सफलतापूर्वक PNIPAM और POEGMA के लिए ऊपर विस्तार में वर्णित विधियों के केवल मामूली बदलाव का उपयोग कर कई बहुलक प्रणालियों के लिए इन सभी निर्माण तकनीकों को लागू किया है; हालांकि, इन प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं को अंय पॉलिमर इन प्रक्रियाओं में प्रतिस्थापित कर रहे है जब पैदा कर सकते है जो संभावित समस्याओं का जानकार होना चाहिए । विशेष रूप से, अग्रदूत पॉलिमर की चिपचिपाहट में वृद्धि नकारात्मक दोनों processibility (विशेष रूप से microfluidic विधि में) के रूप में अच्छी तरह से दो अग्रदूत पॉलिमर के मिश्रण की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अलावा, बहुलक के जमाना समय एक को लक्षित आकृति विज्ञान पर निर्भर दर पर नियंत्रित किया जाना चाहिए क्रम में समय से पहले जमाना कि प्रवाह को बाधित या प्रतिक्रियाशील पूर्व पॉलिमर के प्रसार को रोकने के लिए कार्य करता है, वांछित फार्म आवश्यक सजातीय जेल संरचनाओं । प्रत्येक रणनीति की विशिष्ट सीमाओं, साथ ही दृष्टिकोण हम इन तरीकों को प्रत्येक निर्माण की लंबाई पैमाने पर ऐसी सीमाओं का पता अनुकूलन का इस्तेमाल किया है, नीचे वर्णित हैं ।

डबल बैरल सिरिंज सीओ बाहर निकालना के माध्यम से थोक hydrogels
जमाना समय के लिए थोक hydrogels बनाने के लिए डबल बैरल सिरिंज तकनीक की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण चर है । पॉलिमर कि बहुत तेजी से संपर्क पर जेल (< 1-2 s) स्थिर मिक्सर रोकना कर सकते हैं, या तो प्रवाह को पूरी तरह से रोक या दो अग्रदूत पॉलिमर सिरिंज से निकाला जा रहा है की गैर-stoichiometric मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप । हमने पाया है कि जमाना टाइंस > 5 एस बेहतर कर रहे है (हालांकि आवश्यक नहीं) इस तकनीक के उपयोग के लिए; यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर दोहराने hydrogels भौतिक या यांत्रिक विश्लेषण के लिए डाली जा रही है सुनिश्चित करें कि प्रत्येक hydrogel कास्ट एक ही रचना है । जमाना समय आसानी से एक या दोनों अग्रदूत पॉलिमर पर प्रतिक्रियाशील कार्यात्मक समूहों के घनत्व को बदलने के द्वारा बदला जा सकता है (कम कार्यात्मक समूह घनत्व धीमी जमाना करने के लिए अग्रणी) या के लिए जेल फार्म का इस्तेमाल किया अग्रदूत पॉलिमर की एकाग्रता को बदलने ( कम धीमी जमाना के लिए अग्रणी सांद्रता)21। वैकल्पिक रूप से, (अधिक प्रतिक्रियाशील) एल्डिहाइड समूह (कम प्रतिक्रियाशील) कीटोंन समूह के रूप में बीच बढ़िया तालमेल जोड़ी में electrophile के रूप में काफी जमाना समय काफी बदल जाता है जिसके परिणामस्वरूप hydrogel की संरचना को बदलने केबिना ३५ ; एल्डिहाइड और कीटोंन monomeric अग्रदूतों के मिश्रण के साथ तैयार पॉलिमर के रूप में इस्तेमाल किया अग्रदूत पॉलिमर की एकाग्रता को बदलने के बिना वांछित जमाना समय धुन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और इस प्रकार के परिणामस्वरूप जेल का गठन में ठोस के जन प्रतिशत) ।

हम यह भी ध्यान दें कि पहली hydrogel कास्ट हमेशा बाद hydrogels कास्ट के रूप में एक ही गुण नहीं है, एक प्रेक्षण दर जिस पर दो बैरल की सामग्री वास्तव में स्थिर मिक्सर तक पहुंचने में मामूली अंतर को जिंमेदार ठहराया । एक परिणाम के रूप में, हम आम तौर पर प्रधानमंत्री इस तरह की परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कास्टिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले जेल के एक छोटे (< 0.3 एमएल) अंश बाहर निकालकर डबल बैरल सिरिंज । अंत में, जबकि आम तौर पर समस्याग्रस्त नहीं जब oligomeric सिंथेटिक पूर्व का उपयोग पॉलिमर, एक या एक से अधिक अग्रदूत बहुलक समाधान की चिपचिपाहट इस तकनीक के संदर्भ में एक चुनौती पैदा कर सकता है, सरल अंगूठे अवसाद का उपयोग प्रवाह को सुविधाजनक बनाने के मामले में दोनों साथ ही स्थिर मिक्सर के भीतर प्रभावी मिश्रण को बढ़ावा देने के. हालांकि, कुछ हद तक आश्चर्य की बात है, भी अग्रदूत साबित बहुलक समाधान तेजी से अलग viscosities के साथ अभी भी अपेक्षाकृत सजातीय hydrogels फार्म का उपयोग कर स्थिर मिक्सर भागों सूची में वर्णित संलग्नक (जैसे, एक उच्च आणविक के साथ PNIPAM वजन कार्बोहाइड्रेट26), सुझाव है कि गलत-मिलान viscosities का एक परिणाम के रूप में अक्षम मिश्रण के बारे में चिंताओं को कम से कम थोक पैमाने पर महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है । यदि आवश्यक हो, एक सिरिंज पंप का उपयोग (बजाय अंगूठे के) ड्राइव प्रवाह और/या आउटलेट पर एक बड़ा गेज सुई का उपयोग इन प्रणालियों में बाहर निकालना से जुड़े मुद्दों को दूर करने में मदद कर सकते हैं ।

अतिसूक्ष्म hydrogels वाया प्रतिक्रियाशील microfluidics
महत्वपूर्ण कदम जेल microparticle निर्माण के लिए microfluidics दृष्टिकोण के साथ जुड़े दो प्रतिक्रियाशील पॉलिमर के साथ microfluidics चिप के भड़काने है । यदि पॉलिमर विभिंन दबावों के साथ या अलग दरों पर चिप में वितरित कर रहे हैं, अंतर दबाव जलाशय में एक अग्रदूत बहुलक समाधान के backflow ड्राइव कर सकते है (या जलाशय की ओर) अंय अग्रदूत बहुलक की तरफ कम । कण गठन से जमाना ऊपर में यह परिणाम, प्रभावी ढंग से प्रवाह को अवरुद्ध और इस प्रकार चिप निपटान की आवश्यकता होती है । प्रत्येक जलाशय और मिश्रण बिंदु के बीच अंकित अत्याचारी पथ backflow के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिरोध पैदा करता है; हालांकि, यहां तक कि एक प्रशिक्षित ऑपरेटर कभी एक स्थिर प्रवाह शासन से पहले एक चिप जेल होगा हासिल की है । हमारे अनुभव के आधार पर, 1-2 मिनट के बीच आम तौर पर (जो समय अपेक्षाकृत polydisperse जेल microparticles का उत्पादन कर रहे हैं) छोटी बूंद गठन की दीक्षा के बाद प्रवाह को स्थिर करने के लिए आवश्यक है; आपरेशन के पहले 5-10 मिनट के भीतर कोई समस्या नहीं मनाया जाता है, तो यह निरंतर monodisperse कण उत्पादन के कई घंटे प्राप्त किया जा सकता है कि संभावना है । अपेक्षाकृत अच्छी तरह से मिलान viscosities के साथ ही गैर तात्कालिक जमाना बार के साथ अग्रदूत पॉलिमर के उपयोग (कम से कम > 15 एस बेहतर) बहुत ऐसी समस्याओं से बचने और स्थिर प्रवाह के गठन को बढ़ावा देने में सहायता ।

ध्यान दें कि विभिंन प्रवाह से लेकर दर 0.01-0.1 मिलीलीटर/एच में जलीय चरण और 1.1-5.5 मिलीलीटर/एच तेल चरण में इस चिप डिजाइन का उपयोग कर परीक्षण किया गया है, के आकार सीमा पर कणों के निर्माण के लिए अग्रणी ~ 25-100 µm पर लागू कतरन के अनुसार प्रवाह केंद्रित जंक्शन; तेजी से प्रवाह की दर उच्च कतरनी को समानता और इस प्रकार छोटे कणों31,३२का गठन किया । तेल प्रवाह की दर बदलती जबकि कुल जलीय प्रवाह दर कम (~ ०.०३ एमएल/एच, के रूप में प्रोटोकॉल में उद्धृत) रखने के लिए सबसे अधिक या तो monodispersity या डिवाइस के जीवनकाल, समझौता किए बिना जेल microparticle आकार नियंत्रित करने के लिए सक्षम होना पाया गया था जो दोनों के थे उल्लेख किया कुल जलीय प्रवाह दरों के उच्च अंत में काफी कमी के लिए मनाया । बड़ा तेल प्रवाह दर (> 5.5 एमएल/छोटे कणों को बनाने के लिए संभव हो रहे हैं, लेकिन चिप फाड़ना (एक आम सीमा प्लाज्मा-बंधुआ PDMS microfluidic चिप्स के साथ सामना करना पड़ा) का खतरा बढ़ गया । एक और विधि का उपयोग कर चिप्स संबंध तेजी से प्रवाह दर और इस प्रकार छोटे जेल microparticle उत्पादन, एक रणनीति हम वर्तमान में खोज कर रहे है सक्षम हो सकता है । नोजल के आकार को कम करने के लिए भी microparticles है कि उत्पादन किया जा सकता है, हालांकि समय से पहले जमाना कण के गठन के लिए एक बढ़ जोखिम में, का आकार घटाने में मदद कर सकते हैं । धीमी प्रवाह दर instabilities प्रवाह और इस प्रकार उच्च polydispersities और चिप जमाना का एक बढ़ा जोखिम नेतृत्व करने के लिए खड़ा; इस सीमा एक मल्टीचैनल microfluidic प्रवाह नियंत्रण प्रणाली है कि उच्च स्थिरता और मानक सिरिंज इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया पंपों से उच्च संकल्प है का उपयोग करके दूर किया जा सकता है ।

तेल का चुनाव इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण था, के रूप में भारी तेलों (संग्रह के बाद जेल microparticle ढेर को रोकने के मामले में अनुकूल) प्रकाश सिलिकॉन तेल से नोक पर बहुत कम अनुरूप कण गठन के नेतृत्व में रिपोर्ट प्रोटोकॉल । हम परिकल्पना इस कम reproducibility भारी तेलों के सिरिंज पंपिंग की कम स्थिरता का परिणाम है, मिश्रण बिंदु पर अधिक चर कतरनी के लिए अग्रणी । जेल से बचना संग्रह में microparticle समुच्चय कुप्पी भी एक चुनौती थी, विशेष रूप से तुरंत microfluidic डिवाइस से बाहर निकलने पर जो बिंदु में सीटू जमाना पूर्ण नहीं था और बड़ी संख्या में उपलब्ध प्रतिक्रियाशील कार्यात्मक समूह संग्रह स्नान में टकराने कणों के बीच पुल बनाने के लिए उपलब्ध थे । इस चुनौती से संबोधित किया है: microfluidic चिप पर ही निकास चैनल की लंबाई में वृद्धि, जेल microparticles बनाए रखने के लिए समय की एक लंबी अवधि के लिए लामिना प्रवाह में अधिक पूरा जमाना को बढ़ावा देने के; नोजल के बाद साइड चैनलों को जोड़ने के लिए चिप में और अधिक तेल फ़ीड और इस तरह बेहतर इस पोस्ट में जेल microparticles अलग नोजल ही या कण उत्पादन दर पर कतरनी क्षेत्रों को प्रभावित किए बिना चैनल मिश्रण; और जेल microparticle अवसादन से बचने और आसंन कणों के बीच एक बड़ा औसत जुदाई बनाए रखने के लिए संग्रह कुप्पी के लिए एक चुंबकीय मिक्सर जोड़ने । जबकि बहुत धीमी गति से बीच बढ़िया तालमेल पॉलिमर की संभावना डिवाइस स्थिरता में सुधार होगा और भड़काना के साथ मुद्दों को कम करने, इस तरह के सिस्टम भी काफी प्रतिक्रियाशील कार्यात्मक समूहों की एक बड़ी संख्या के रूप में, जेल microparticle एकत्रीकरण के जोखिम को बढ़ाने के लिए मनाया गया (और इस प्रकार अंतर-कण पुलों फार्म करने में सक्षम) एक लंबी अवधि के दौरान प्रतिक्रिया व्यक्त की है । जैसे, 15-60 एस के आदेश पर जमाना बार इस तकनीक के लिए इष्टतम होना प्रकट: काफी धीमा भड़काना लेकिन तेजी से सक्षम करने के लिए सबसे प्रतिक्रियाशील समूह सुनिश्चित करने के लिए पहले जेल microparticles में लामिना प्रवाह चैनल से बाहर निकलने से भस्म कर रहे है संग्रह कुप्पी.

अंत में, templating तेल को हटाने के लिए सुनिश्चित करें कि जिसके परिणामस्वरूप कणों स्मार्ट पूर्व की संरचना के आधार पर प्रत्याशित गुण बनाए रखने के लिए आवश्यक है पॉलिमर जोड़ा और एक बायोमेडिकल संदर्भ में इन कणों का उपयोग सक्षम करें । पेंटेन वाशिंग प्रक्रिया वर्णित अत्यधिक जनरल जेल microparticle उत्पादन के लिए इस संबंध में प्रभावी था । हालांकि, एक प्रत्यक्ष जैव चिकित्सा संदर्भ में इस तकनीक के आवेदन (जैसे, पर चिप सेल encapsulation) फिर से इस प्रोटोकॉल के मूल्यांकन की आवश्यकता होगी । हम भी जैतून का तेल के उपयोग का पता लगाया है, के लिए३६कोशिकाओं से संपर्क के संदर्भ में एक और अधिक निष्क्रिय तेल होने का सुझाव दिया, के रूप में disperser । जबकि कण गठन संभव था, जेल microparticle आबादी काफी अधिक से अधिक polydisperse खनिज तेल के साथ प्राप्त किया जा सकता है, मौजूदा चिप डिजाइन के साथ कम से कम थे । इस प्रकार, जबकि चिप के लिए दोनों सिंथेटिक बहुलक और प्राकृतिक बहुलक जेल microparticle गठन31के लिए अनुकूलनीय प्रतीत होता है, एक संशोधित डिजाइन के लिए इस तकनीक का दोहन अधिक मोटे तौर पर सभी संभव सामग्री संयोजन के पार की आवश्यकता हो सकती है ।

नेनो hydrogels के जरिए प्रतिक्रियाशील स्व-विधानसभा
Nanogels बीज बहुलक के विभिंन सांद्रता (0.5-2 wt%), crosslinking के विभिंन अनुपात: बीज बहुलक (0.05-0.2), विभिंन तापमान (40-80 डिग्री सेल्सियस), विभिंन मिश्रण गति सहित प्रसंस्करण शर्तों की एक बहुत व्यापक रेंज का उपयोग कर गठन किया गया है ( 200-800 rpm), और विभिंन ताप crosslinker बहुलक (2-60 मिनट)28के अलावा निंनलिखित बार । सांद्रता के संदर्भ में, आम तौर पर मनाया प्रवृत्तियों के रूप में भविष्यवाणी की जाएगी, बीज बहुलक सीसा के उच्च सांद्रता के रूप में बड़ा nanogels और crosslinker के उच्च अनुपात: बीज बहुलक सीसा उच्च crosslink घनत्व के साथ nanogels करने के लिए और इस प्रकार कम thermoresponsivities । यह बल दिया जाना चाहिए कि बीज बहुलक एकाग्रता में वृद्धि भी उच्च अंततः थोक एकत्रीकरण की ओर जाता है के रूप में nanoaggregation का विरोध किया, क्या पारंपरिक मुक्त कट्टरपंथी वर्षा प्रक्रिया में मनाया जाता है के साथ संगत बनाने के लिए thermoresponsive nanogels3. छोटा हीटिंग बार भी छोटे और अधिक monodisperse कणों के गठन के लिए अनुकूल होना पाया गया । हम परिकल्पना है कि पकड़े nanoaggregate LCST एक या दोनों अग्रदूत पॉलिमर के ऊपर एक तापमान पर लंबे समय में nanogel टक्कर पर एकत्रीकरण की संभावना बढ़ जाती है, hydrophobicity बांड के सापेक्ष वृद्धि हुई hydrazone के साथ या तो एल्डिहाइड या हयद्रज़ीदे कार्यात्मक समूह इस एकत्रीकरण अधिक crosslinking की डिग्री की संभावना के रूप में प्राप्त कर वृद्धि हुई है । अंत में, छोटे हीटिंग बार एक प्रक्रिया के नजरिए से अनुकूल हैं, के रूप में एक monodisperse nanogel जनसंख्या crosslinker बहुलक इसके अलावा के बाद के रूप में छोटे रूप में 2 मिनट में गठन किया जा सकता है; 10 मिनट के लिए सबसे लंबे समय है कि लगातार monodisperse nanogels उत्पादन सकता है, जबकि भी अधिक उच्च crosslinked nanogels के उत्पादन के लिए अनुमति मिल गया था । दिलचस्प है, विधि उल्लेखनीय मिश्रण करने के लिए असंवेदनशील है, लगभग समान कण आकार और कण आकार वितरण अलग गति से मिश्रण या भी बड़ी मात्रा में प्रक्रिया स्केलिंग से जिसके परिणामस्वरूप के साथ । हालांकि शुरू में इस परिणाम से आश्चर्यचकित है, यह संभावना nanogel उत्पादन को विनियमित करने में ऊष्मा की प्राथमिक भूमिका के लिए बोलती है ।

कम polydispersities प्राप्त करने के लिए, कोलाइडयन स्थिरता और nanoaggregate के जलयोजन की डिग्री के लिए महत्वपूर्ण चर दिखाई देते हैं । उदाहरण के लिए, nanoaggregates अधिक हाइड्रोफिलिक हयद्रज़ीदे के रूप में कार्यात्मक पॉलिमर का उपयोग करने के रूप में कम हाइड्रोफिलिक एल्डिहाइड कार्यात्मक पॉलिमर के विरोध के रूप में काफी कम nanogels के साथ polydispersities का नेतृत्व तैयार किया । प्रयोगात्मक विधानसभा के तापमान और बीज बहुलक के LCST के बीच अंतर भी महत्वपूर्ण है । सिर्फ बीज बहुलक LCST ((T-LCST) < 5 ° c) के ऊपर एक तापमान पर ऑपरेटिंग monodisperse nanogel गठन की उच्चतम संभाव्यता प्रदान करता है; LCST के ऊपर अच्छी तरह से ऑपरेटिंग अधिक hydrophobic और ढह nanoaggregates कि और अधिक समग्र और कम crosslink करने की संभावना है, जबकि एक अपेक्षाकृत गैर कॉंपैक्ट बीज बहुलक है कि प्रभावी ढंग से या नहीं किया जा सकता है में LCST परिणामों के नीचे काम करने की संभावना है बनाता है reproducibly crosslinked. कण monodispersity का सबसे अच्छा पूर्वानुमान के लिए, हम पहले एक यूवी/विज़ स्कैन करने के लिए बीज बहुलक की शुरुआत LCST उपाय और बाद में एक तापमान 1-2 डिग्री सेल्सियस पर आत्म विधानसभा प्रक्रिया है कि LCST के ऊपर प्रदर्शन की सलाह देते हैं ।

ध्यान दें कि इस विधि का उपयोग कर उत्पादित nanogels lyophilized हो सकता है और कोलाइडयन स्थिरता में किसी भी परिवर्तन के बिना फिर से फैलाया, स्व के लिए संभव नहीं है-इकट्ठे संरचनाओं और हमारे अपने crosslinking स्थिरीकरण विधि के कारण विचार में । हम यह भी पूर्वानुमान है कि केवल बीज बहुलक की जरूरत है इस विधि के लिए काम करने के लिए thermoresponsive; या तो गैर-उत्तरदायी या अन्य उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी हैं क्रॉस-लिंकिंग पॉलिमर का उपयोग इस तकनीक के अंतिम प्रयोज्यता को व्यापक कर सकता है । अंत में, के बाद से दो प्रतिक्रियाशील प्रणेता पॉलिमर के मिश्रण इस निष्क्रिय मामले में है के रूप में सक्रिय करने का विरोध किया, जमाना समय बहुत कम महत्वपूर्ण है प्रक्रिया नियंत्रण के मामले में अंय निर्माण रणनीतियों के सापेक्ष वर्णित है । हालांकि, यहां तक कि इस तकनीक में, कुल crosslinking समय < 30 मिनट रखने से कण एकत्रीकरण के जोखिम को कम करने के लिए वांछनीय है ।

Nanofibrous hydrogels वाया प्रतिक्रियाशील electrospinning
प्रतिक्रियाशील पूर्व के जमाना समय को नियंत्रित पॉलीमर्स जेल nanofiber उत्पादन की सफलता के लिए फिर से आवश्यक है । विशेष रूप से, लगभग स्थिर मिक्सर में अग्रदूत पॉलिमर के निवास समय मिलान (डबल बैरल सिरिंज से समाधान के प्रवाह की दर को बदलने के साथ ही लंबाई और स्थिर मिक्सर के tortuosity) थोक जमाना के साथ नियंत्रित अग्रदूत पॉलिमर के समय दोनों spinnability के संरक्षण के साथ ही सुई और कलेक्टर के बीच काता तंतुओं के प्रभावी crosslinking सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । तेजी से जमाना अप्रभावी टेलर शंकु विकास की ओर जाता है और इस प्रकार गरीब spinnability, जबकि एक जलीय समाधान में धीमी जमाना परिणाम के बजाय एक कलेक्टर मार जेल के, प्रसार में जिसके परिणामस्वरूप और के बजाय एक पतली फिल्म जेल के अंतिम गठन nanofibers । निवास समय पर थोड़ा थोक जमाना समय से नीचे काम भी प्रभावी हो पाया गया है (और वास्तव में बेहतर सुई कॉलेस्ट्रॉल के जोखिम को कम करने के लिए) के रूप में पानी के वाष्पीकरण के बाद से हल प्रभावी ढंग से प्रकाता है में अग्रदूत पॉलिमर ध्यान केंद्रित स्ट्रीम और इस प्रकार कताई प्रक्रिया के दौरान जमाना कैनेटीक्स में बढ़ौतरी । यह एक ही नस में, उच्च सुई से कलेक्टर दूरी पर सक्रिय (> 10 सेमी) आम तौर पर इस प्रक्रिया में अनुकूल है, के रूप में कम दूरी पानी वाष्पीकरण के लिए उपलब्ध समय को कम करने और इस तरह के बीच संबंधों पर और अधिक कठोर नियंत्रण की आवश्यकता एक nanofibrous उत्पाद को संरक्षित करने के लिए निवास का समय और जमाना समय ।

ध्यान दें कि पेो का उपयोग करें (या एक और उच्च आणविक वजन और आसानी से electrospun बहुलक) इस प्रोटोकॉल में आवश्यक है nanofiber गठन को बढ़ावा देने के लिए, के रूप में लघु और उच्च शाखाओं में POEGMA oligomers अकेले नहीं उलझाव के एक पर्याप्त डिग्री तक पहुंचने के लिए प्रेरित कर सकते है electrospinning; इसके बजाय, सभी प्रक्रिया POEGMA-केवल योगों के लिए परीक्षण की शर्तों पर परिणाम electrospray (हालांकि यह भी एक ही रसायन विज्ञान का उपयोग कर क्षरण जेल कणों बनाने के लिए आवेदन हो सकता है) । 1 wt% (1 एमडीए आणविक भार) की एक ंयूनतम पेो एकाग्रता के लिए एक पूरी तरह से nanofibrous आकृति विज्ञान बनाए रखने की आवश्यकता है । ध्यान दें कि पेो nanofibrous नेटवर्क की अखंडता को बाधित किए बिना एक सरल भिगोने की प्रक्रिया (जल, 24 एच) के बाद तंतुओं से हटाया जा सकता है; इस तरह, पेो अंतिम nanofibrous उत्पाद की एक अनिवार्य घटक की तुलना में एक क्षणिक electrospinning सहायता के रूप में अधिक कार्य करता है । नोट भी है कि कलेक्टरों के विभिंन प्रकार, सरल एल्यूमीनियम पंनी सहित (पतली परत hydrogels कि भिगोने पर कलेक्टर से फाड़ना कर सकते है बनाने के लिए) के रूप में अच्छी तरह से एक घूर्णन एल्यूमीनियम डिस्क (मोटा पाड़ बनाने के लिए) के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है यह वही तकनीक, जमाना की दर को नियंत्रित करने के अन्य प्रक्रिया चर प्रदान की, electrospinning की दर, और electrospinning के दौरान पानी वाष्पीकरण की दर अनछुए रहते हैं.

दिलचस्प है, अलग morphologies तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया विधि पर निर्भर करता है, महत्वपूर्ण मतभेदों को एक ही hydrogel पुरोगामी से तैयार hydrogels के क्षरण के समय में मनाया गया है । उदाहरण के लिए, POEGMA nanofibrous hydrogels अपने काफी उच्च सतह क्षेत्र के बावजूद एक ही रचना के साथ थोक POEGMA hydrogels से धीमी नीचा और इस प्रकार hydrolyze बांड hydrazone करने के लिए पानी के लिए उपयोग । हम इन मतभेदों को वर्णित प्रोटोकॉल के बीच अंतर्निहित विरोधाभासों के संदर्भ में जो आंतरिक जेल सजातीयताओं के लिए नेतृत्व कर सकते है और/या morphologies कि काफी अलग है और/या में के अग्रदूत पॉलिमर, मिश्रण की ज्यामिति की दृष्टि से संबंधित जमाना, विशेष रूप से एक साथ पानी के वाष्पीकरण और crosslinking इस प्रक्रिया में मनाया के कारण electrospinning में प्रासंगिक के रूप में एक ही समय पैमाने पर बहुलक पूर्ववर्ती की एकाग्रता सीटू । हालांकि यह कुछ हद तक अगर एक बहुलक प्रत्येक प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए लक्षित है, यह भी एक रासायनिक संरचना लेकिन बहुत अलग भौतिक गुणों के साथ hydrogels बनाने के मामले में एक तकनीकी अवसर प्रदान कर सकते है अग्रदूत साबित पॉलिमर के विकल्प जटिल हो सकता है ।

कुल मिलाकर, तरीकों को कई लंबाई तराजू (थोक, माइक्रो, और नैनो) पर और आंतरिक संरचनाओं के कई प्रकार के साथ thermoresponsive पॉलिमर के एनालॉग (या कम से कम गुर्दे स्पष्ट) के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रदान वर्णित (कणों या तंतु). इस तरह के प्रोटोकॉल पारंपरिक के सफल अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं को पता है-जैव चिकित्सा क्षेत्र के लिए सिंथेटिक thermoresponsive सामग्री तैयार: इंजेक्शन और क्षरण । हम दवा वितरण और ऊतक इंजीनियरिंग दोनों में ऐसी सामग्री के आवेदन का पता लगाने के लिए जारी कर रहे है कैंसर के भौतिक लक्ष्यीकरण से लेकर आवेदन, रक्त मस्तिष्क बाधा पार दवाओं के परिवहन, पर प्रोटीन की चिकित्सीय वितरण आंख के पीछे, ऊतकों के दिशात्मक विकास, और thermoreversible आसंजन और कोशिकाओं के भेदभाव, अंय अनुप्रयोगों के बीच ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), NSERC बनाने-वही (Extracellular मैट्रिक्स के एकीकृत डिजाइन) कार्यक्रम, 20/20: NSERC नेत्र जैव सामग्री अनुसंधान नेटवर्क से धन, और ओंटारियो अनुसंधान मंत्रालय और अभिनव जल्दी शोधकर्ता पुरस्कार कार्यक्रम स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,2 - azobisisobutryic acid dimethyl ester Wako Chemicals 101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) Sigma Aldrich 447927 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) Sigma Aldrich 447943 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99% Sigma Aldrich 147230
Thioglycolic acid (TGA), 98% Sigma Aldrich T3758
Dioxane, 99% Caledon Labs 360481
Nitrogen, UHP grade Air Liquide Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% Alfa Aesar A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) Carbosynth FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37% Sigma Aldrich 320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97% Sigma Aldrich 221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% Sigma Aldrich 121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97% Sigma Aldrich 176141
Methacryloyl chloride,97x% Sigma Aldrich 523216
Petroleum ether, 95% Sigma Aldrich 32047
Magnesium sulfate, 99.5% Sigma Aldrich M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0% Sigma Aldrich 443808
Phosphate buffered saline BioShop PBS405.1 1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99% J&K Scientific 258717 Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous Commerical Alchols P016EAAN
Span 80 Sigma Aldrich S6760
Heavy paraffin oil Caledon Labs 1326197
Pentane, reagent grade Caledon Labs 1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 Sigma Aldrich 182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator Heidolph G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) Spectrum Labs 28170-166 Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness McMaster-Carr 9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump KD Scientific KDS Legato 200 Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply Spellman 230-20R 0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer University Wafer 2080 D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation 
SU-8 100 MicroChem Y131273
SU-8 Developer MicroChem Y020100
Custom 2.5" spincoater Built in-house N/A
Mask Aligner KARL SUSS MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing Cole Parmer OF-96400-13 Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base  Ellsworth Adhesives 4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent  Ellsworth Adhesives 4019862
High Power Plasma Cleaner  Harrick PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester Biomomentum LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate Greiner Bio-one 665 180
Cell culture insert for 12 well plate Corning 08-771-12 8 µm pore size
Optical microscope Olympus BX51 optical microscope BX51
Temperature-controlled microscope stage Linkam Scientific THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC) Waters 590 HPLC Pump Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS) Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM) TEMSCAN JEOL 1200EX Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM) Tescan Vega II LSU Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher CellScale Biomaterials Testing MS-50M-01

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References

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-अभियांत्रिकी अंक १३४ Hydrogels स्मार्ट सामग्री Thermoresponsive सामग्री पाली (एन-Isopropylacrylamide) पाली (Oligoethylene ग्लाइकोल Methacrylate) क्षरण में सीटू बीच बढ़िया तालमेल Microfluidics स्व-विधानसभा Electrospinning
एकाधिक लंबाई तराजू पर प्रतिक्रियाशील बाहर निकालना, Microfluidics, स्व-विधानसभा, और Electrospinning के माध्यम से एक अपमानजनक Thermoresponsive Hydrogels बनाना
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Sivakumaran, D., Bakaic, E.,… More

Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).

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