En ikke-invasiv og Teknisk Non-intensiv metode for induksjon og fenotyping of Experimental bakteriell lungebetennelse hos mus
Summary
Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen for modellering av bakteriell lungebetennelse hos mus. Heri beskriver vi en ikke-invasiv, billig, rask fremgangsmåte for indusering av pneumoni via aspirasjon (dvs. inhalering) av et bakterielt inokulum pipettert over i oropharynx. Nedstrøms metoder for vurdering av lunge medfødte immunrespons er også detaljert.
Abstract
Selv om smittsom lungebetennelse er fortsatt et stort folkehelseproblem, har murine modeller av bakteriell lungebetennelse nylig tilrettelagt betydelige prekliniske fremskritt i vår forståelse av de underliggende cellulære og molekylære patogenesen. In vivo musemodeller fange integrert fysiologi og robusthet i vertens forsvar respons i en måte som ikke er avslørt av alternative, forenklede ex vivo tilnærminger. Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen for intrapulmonal inokulering av bakterier i mus, inkludert aerosolisering, intranasal levering, peroral endotrakeal kanylering under "blind" og visualisert forhold, og transkutan endotrakeal kanylering. Alle metoder har relative fordeler og begrensninger. Heri beskriver vi i detalj en ikke-invasiv, teknisk sett ikke-intensive, billig og hurtig metode for intratrakeal levering av bakterier som involverer aspirasjon (dvs. inhalering) av musenav en infeksiøs inokulum pipettert over i oropharynx mens under generell anestesi. Denne metoden kan benyttes for pulmonal avlevering av et vidt spekter av ikke-kaustiske biologiske og kjemiske midler, og er forholdsvis lett å lære, selv for laboratorier med minimal tidligere erfaring med pulmonal prosedyrer. I tillegg til å beskrive aspirasjonspneumoni metode, tilbyr vi også trinnvise prosedyrer for analysering av påfølgende in vivo lunge medfødte immunrespons av musen, spesielt metoder for å kvantifisere bakteriell klaring og den cellulære immunrespons av den infiserte luftveier. Denne integrerte og enkel tilnærming til lungebetennelse vurderings gir mulighet for hurtig og robust evaluering av effekten av genetiske og miljømessige manipulasjoner på lunge medfødt immunitet.
Introduction
Smittsom lungebetennelse er fortsatt den ledende dødsårsaken fra infeksjon i USA, med litt generell endring i dødelighet i løpet av de siste 40 årene til tross for forbedringer i vaksinering og antibiotika strategier 1,2. Til tross for mangelen på merkbar framgang på folkehelsenivå, i de senere årene dramatiske fremskritt har blitt gjort i vår forståelse av molekylære og cellulære patogenesen av lungebetennelse, med mange av disse trinnene frem gjort mulig ved bruk av musemodeller av lungebetennelse. Den genetiske tractability av musen, har likheten av murine og humane immunforsvar, og det store utvalget av murine målrettede immunologiske reagenser som har blitt kommersielt tilgjengelig sammen tilrettelagt rask fremgang av feltet.
Musemodeller av bakteriell lungebetennelse beskrevet i litteraturen har generelt grunnlag en av fire tekniske ruter for patogen vaksinasjon: i) forstøvning; ii) intranasal levering; iii) peroral levering; og iv) kirurgisk intratrakeal injeksjon (dvs. trakeotomi) 3. Alle rutene på infeksjon har fordeler og ulemper 3. Spesielt relative eksponering av øvre luftveier, potensialet for innblanding av oronasal flora, krav til generell anestesi, variasjon av podestoff levert til distale lunge, lobar fordelingen av de leverte patogener, tekniske krav til kompetanse, og prosessuelle sykelighet varierer mye på tvers av disse tilnærminger.
Vanligvis brukes perorale infeksjon teknikker inkluderer endotrakeal (translaryngeal) kanylering via enten en "blind" (non-visualisert) tilnærming, eller under direkte strupe visualisering 3-5. Begge metodene, mens robust, krever betydelig trening og også innebære risiko for skade på øvre luftveier. I den foreliggende rapport beskriver vi en teknisk sett ikke-intensive, ikke-invasiv, billig og hurtig metode for peroral smitte, wherved bakterier (Klebsiella pneumoniae i eksempelet som er vist) pipettert over i oropharynx av en bedøvet mus leveres til lungene via aspirasjon (dvs. inhalering). Vi og andre har brukt aspirasjonslungebetennelse teknikken med hell 6-9. Denne allsidige og lett lært lunge-leveringsmetode kan utvides til levering av mange flere ikke-kaustiske midler til lungene, inkludert cytokiner og andre proteiner, patogen-forbundet molekyler (f.eks lipopolysakkarid), celler (dvs. adoptiv overføring), og giftstoffer (for eksempel bleomycin). I tillegg til å diskutere viktige tekniske hensyn, vi beskriver også en integrert, kvantitativ tilnærming for å vurdere den påfølgende vertsrespons til lungebetennelse, inkludert nedstrøms måling av bakteriell clearance (dvs. kolonidannende enhet [CFU] kvantifisering i lunge og perifere organer) og leukocytter akkumulering i luftrommet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine modeller av bakteriell lungebetennelse, inngått samarbeid med genet targeting og in vivo biologiske og farmakologiske intervensjoner, har gitt kritisk innsikt i lunge vertens forsvar respons. Store fremskritt er gjort spesielt i vår forståelse av kjemokiner og adhesjonsmolekyler som styrer rekruttering av nøytrofile til den infiserte luftrom 10,11. In vivo modeller av lungebetennelse, i motsetning til cellebaserte eller alternative tilnærminger, har også gitt viktige innsikt i e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
