Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones
Summary
Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.
Abstract
Aunque la neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo un problema importante de salud pública, los modelos murinos de neumonía bacteriana han facilitado recientemente importantes avances preclínicos en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular subyacente. En vivo modelos de ratón capturan la fisiología integrada y capacidad de recuperación de la respuesta de defensa del huésped en de una manera no reveló por enfoques alternativos, simplificados ex vivo. Varios métodos han sido descritos en la literatura para la inoculación intrapulmonar de bacterias en ratones, incluyendo la aerosolización, la administración intranasal, la canulación endotraqueal peroral en condiciones "ciego" y visualizados, y la canulación endotraqueal transcutánea. Todos los métodos tienen ventajas relativas y limitaciones. En este documento, se describe en detalle un método no invasivo, técnicamente no intensiva, barato y rápido para la entrega intratraqueal de bacterias que consiste en la aspiración (es decir, inhalación) por el ratónde un inóculo infeccioso pipeteó en la orofaringe, mientras que bajo anestesia general. Este método se puede utilizar para la administración pulmonar de una amplia variedad de agentes biológicos y químicos no cáusticos, y es relativamente fácil de aprender, incluso para los laboratorios con experiencia previa mínima con procedimientos pulmonares. Además de describir el método de la neumonía por aspiración, también ofrecemos procedimientos paso a paso para ensayar la posterior in vivo la respuesta inmune innata pulmonar del ratón, en particular, los métodos para cuantificar la eliminación de bacterias y la respuesta inmune celular de las vías respiratorias infectadas. Este enfoque integrado y sencillo de evaluación neumonía permite la evaluación rápida y robusta de los efectos de las manipulaciones genéticas y ambientales en la inmunidad innata pulmonar.
Introduction
Neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo la causa principal de muerte por infección en los EE.UU., con poco cambio en las tasas de mortalidad en los últimos 40 años a pesar de las mejoras en la vacunación y estrategias de antibióticos 1,2. A pesar de la falta de progresos importantes en el ámbito de la salud pública, en los últimos años dramáticos avances se han hecho en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular de la neumonía, con muchos de estos avances hechos posibles por el uso de modelos de ratón de infección pulmonar. La trazabilidad genética del ratón, la similitud de la murina y el sistema inmunológico humano, y la gran variedad de reactivos inmunológicos murinos-dirigida que se han convertido en disponible en el mercado en su conjunto han facilitado el rápido progreso del campo.
Los modelos de ratón de la neumonía bacteriana descrita en la literatura en general, se han basado en una de las cuatro rutas técnicas para la inoculación de patógenos: i) aerosolización; ii) intrAnasal entrega; iii) la entrega por vía oral; y iv) la inyección intratraqueal quirúrgico (es decir, traqueotomía) 3. Todas las vías de infección tienen ventajas y desventajas 3. En particular, la exposición, relativa de la vía aérea superior, el potencial para la mezcla de la flora oronasales, los requisitos para la anestesia general, la variabilidad del inóculo entregado al pulmón distal, distribución lobular de los patógenos entregados, los requisitos de pericia técnica, y la morbilidad de procedimiento varían ampliamente entre éstos enfoques.
Comúnmente usadas técnicas de infección perorales incluyen endotraqueal canulación (translaríngea), ya sea a través de un enfoque "a ciegas" (no visualizado), o bajo visualización directa de la laringe 3-5. Ambos métodos, mientras robusto, requieren una formación sustancial y también conllevan un riesgo de traumatismo en la vía aérea superior. En el presente informe se describe un método técnicamente no intensiva, no invasiva, barata y rápida de la infección por vía oral, wdeclara bacterias (Klebsiella pneumoniae en el ejemplo proporcionado) pipetearon en la orofaringe de un ratón anestesiado se entregan a los pulmones a través de aspiración (es decir, la inhalación). Nosotros y otros han utilizado la técnica de la neumonía por aspiración con éxito 6-9. Este método de pulmón de entrega versátil y fácil de aprender puede extenderse a la entrega de muchos agentes no cáusticos adicionales a los pulmones, incluyendo citoquinas y otras proteínas, moléculas asociados a patógenos (por ejemplo, lipopolisacáridos), células (es decir, la transferencia adoptiva), y toxinas (por ejemplo, bleomicina). Además de discutir las consideraciones técnicas importantes, como la descripción de un enfoque integrado, cuantitativo para evaluar la respuesta del huésped después de la neumonía, incluyendo la medición aguas abajo de la eliminación de bacterias (es decir, unidades formadoras de colonias [UFC] cuantificación de los órganos pulmonares y periféricos) y leucocitos acumulación en el espacio aéreo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos murinos de neumonía bacteriana, se asociaron con la orientación de genes y en las intervenciones biológicas y farmacológicas in vivo, han proporcionado una perspectiva crítica en la respuesta de defensa del huésped pulmonar. Grandes avances se han hecho en particular en nuestra comprensión de las quimiocinas y moléculas de adhesión que rigen el reclutamiento de neutrófilos al espacio aéreo infectada 10,11. En modelos in vivo de neumonía, a diferencia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
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