Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
परमाणु जीनोम इसके अलावा, प्रत्येक यूकेरियोटिक सेल भी mitochondrial मैट्रिक्स में छोटे परिपत्र डीएनए की प्रतियां के हजारों शामिल हैं। जबकि mitochondrial डीएनए (mtDNA) इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के लिए आवश्यक सब यूनिटों को कूटबद्ध, mitochondrial proteome का बहुमत है, प्रतिकृति और mtDNA के प्रतिलेखन के लिए सभी कारकों सहित परमाणु जीनोम से इनकोड किया गया है। परमाणु जीनोम कि विरासत का मेंडेलियाई कानून इस प्रकार के विपरीत, पशु mitochondrial जीनोम मातृ वंश के माध्यम से विशेष रूप से विरासत में मिली है। इसलिए, समझ कैसे mtDNA प्रचूर मात्रा में और एक पीढ़ी से महिला oocyte के माध्यम से अगले करने के लिए प्रसारित किया जाता है मूल रूप से महत्वपूर्ण है। हालांकि, वहाँ कैसे mtDNA प्रतिकृति महिला germline में विनियमित है पर जारी बहस चल रही है। इसके अतिरिक्त, mtDNA संचरण के लिए व्यापक रूप से स्वीकार mtDNA टोंटी सिद्धांत चलता है कि मौलिक जर्म कोशिकाओं में mtDNA की आबादी ड्यूरिन एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या को subsampled हैजी विकास 1 2। यह भी संकेत मिलता है कि mtDNA प्रतिकृति अस्थायी और oogenesis दौरान स्थानिक विनियमित है। इसलिए, बगल में germline विकास के दौरान mtDNA प्रतिकृति का पता लगाने के mtDNA विरासत के तंत्र की समझ की सुविधा होगी।
ड्रोसोफिला oogenesis mtDNA प्रतिकृति और ट्रांसमिशन अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से विनयशील प्रणाली प्रदान करता है। दो ड्रोसोफिला अंडाशय से प्रत्येक में, वहाँ ovarioles 3 बुलाया अंडा कक्षों में से 16-20 स्वतंत्र तार, जो अंडा उत्पादन के कार्यात्मक इकाइयां हैं (चित्रा 1 ए देखें) कर रहे हैं। प्रत्येक ovariole oogenesis, जहां पूर्वकाल टिप एक संरचना germarium कहा जाता है से बना है की एक प्रगतिशील रेखीय संगठन शामिल हैं। germarium आगे चार क्षेत्रों है कि अलग-अलग विकास के चरणों में रोगाणु कोशिकाओं होते हैं में विभाजित है। क्षेत्र में 1, germline स्टेम कोशिकाओं विषम प्रभाग के माध्यम से जाना बेटी ग के रूप में जाना जाता कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिएystoblasts। क्षेत्र 2A cystoblasts कि उनके अंतिम विभाजन पूरा कर लिया है शामिल हैं। Cystoblasts विभाजन का उत्पादन 16 सेल समूहों के चार दौर से गुजरना। 16 कोशिकाओं cytoplasmic पुलों अंगूठी नहरों बुलाया द्वारा एक दूसरे से जुड़े रहते हैं। केवल कोशिकाओं में से एक, oocyte के रूप में भेदभाव के लिए करता है, जबकि अन्य 15 polyploid नर्स कोशिकाओं के रूप में विकसित करना। एक आवश्यक cytoplasmic संरचना, fusome के रूप में जाना जाता है, अंगूठी नहरों के गठन के साथ की सुविधा पुटी polarity और नर्स सेल oocyte बातचीत 4,5 निर्धारित करने का प्रस्ताव है। अल्सर क्षेत्र 2 बी की ओर बढ़ने, पुटी संरचनाओं germarium की पूरी चौड़ाई अवधि, और अधिक कूप कोशिकाओं के साथ जुड़ा हो। germarium संरचनाओं क्षेत्र 3 पहले नवोदित अंडा चैम्बर युक्त के साथ खत्म होता है। बाद में, अंडा कक्षों germarium, जो 14 आकृति विज्ञान के अलग चरणों में ovariole के माध्यम से प्रगति के पीछे अंत में इकट्ठा कर रहे हैं। oocyte के विकास, नर्स कोशिकाओं पर निर्भर करता है कआईसीएच परिवहन प्रोटीन, mRNA और endomembrane संरचनाओं (जैसे, Golgi) oocyte में अंगूठी नहरों के माध्यम से। ड्रोसोफिला oogenesis के दौरान यह पाया गया है कि प्रत्येक 16 सेल पुटी के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया का एक अंश fusome के साथ जुड़े थे, अंगूठी नहरों के माध्यम से ले जाया गया और एक बड़ी Balbiani शरीर 6 बुलाया मास में एकल oocyte में कर दिया गया था। यह घटना महिला के अंडाशय के माध्यम से mitochondrial विरासत की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए योगदान करने के लिए प्रस्तावित किया गया था।
mtDNA संश्लेषण की जांच सेलुलर डीएनए में लेबल डीएनए व्यापारियों के समावेश पर निर्भर करता है। परंपरागत रूप से, thymidine 5-ब्रोमो-2'- deoxyuridine की एक nucleoside अनुरूप (BrdU) टिशू कल्चर कोशिकाओं 7,8 में mtDNA प्रतिकृति लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, एंटीबॉडी आधारित BrdU लेबलिंग विशेष रूप से पूरे माउंट ऊतक धुंधला के लिए कई सीमाओं को दर्शाती है। BrdU लेबलिंग का एक बड़ा नुकसान यह है कि यह डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता को बेनकाब करने के लिए हैBrdU मिलान, इतना है कि यह विरोधी BrdU एंटीबॉडी से पता लगाया जा सकता है। नमूना इस तरह के रसायनों (जैसे, हाइड्रोक्लोरिक एसिड या मेथनॉल और एसिटिक एसिड के मिश्रण), गर्मी, या DNase साथ पाचन के रूप में कठोर अप्राकृतिकरण की स्थिति है, जो नमूना की संरचना को बाधित और निम्न धुंधला प्रक्रिया 9 उलझा सकता है के तहत इलाज किया जाना है, 10।
इधर, एक वैकल्पिक thymidine अनुरूप 5-ethynyl 2'- deoxyuridine (edu) ड्रोसोफिला वयस्क अंडाशय में नकल mitochondrial डीएनए लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस विधि को तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील है। Edu आसानी से डीएनए प्रतिकृति के दौरान सेलुलर डीएनए में शामिल किया है। निम्नलिखित का पता लगाने के एक "क्लिक" प्रतिक्रिया पर आधारित है, एक घन (मैं) टर्मिनल alkyne समूह और एक फ्लोरोसेंट azide 10 के बीच सहसंयोजक प्रतिक्रिया -catalyzed। क्योंकि प्रतिक्रिया नमूना के विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है, यह अच्छा संरचनात्मक संरक्षण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, डाई एक का आकारZide एक एंटीबॉडी अणु 10 है, जो पूरे माउंट ऊतकों की तेज और कुशल प्रवेश सक्षम बनाता है की है कि केवल 1/500 है। हम ड्रोसोफिला oogenesis दौरान mtDNA प्रतिकृति पता लगाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया और ड्रोसोफिला अंडाशय 11 की germarium क्षेत्र में एक हड़ताली स्थानिक पैटर्न है, जो हमें आगे के लिए एक प्रतिकृति पर निर्भर mtDNA चयनात्मक विरासत तंत्र का प्रस्ताव करने के लिए मिल गया है। हम यहाँ ड्रोसोफिला अंडाशय में mtDNA प्रतिकृति के edu लेबलिंग पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। (: Coi T300I मीट्रिक टन) 11, साथ ही साथ mitochondrial uncouplers, जो mitochondrial झिल्ली क्षमता नष्ट करना और संभावित mtDNA प्रतिकृति को बाधित करने के लिए विभिन्न उपचार प्रोटोकॉल के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम भी एक mtDNA उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला में mtDNA प्रतिकृति का परीक्षण किया।
Edu लेबलिंग proliferating कोशिकाओं है, जो समावेश और नए संश्लेषित डीएनए में nucleoside analogues के धुंधला पर आधारित है में डीएनए संश्लेषण पता लगाने के लिए एक उपन्यास और कारगर तरीका है। इस विधि से यह तेजी से और बेहद संवेदनशील है कि में BrdU लेबलिंग विधि से बेहतर है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह 9 माउंट पूरे ऊतकों, 10। ऐतिहासिक, BrdU लेबलिंग करने के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में, edu लेबलिंग के एस चरण के दौरान परमाणु डीएनए प्रतिकृति के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था अच्छा संरचनात्मक संरक्षण और कुशल की एडू-डाई प्रवेश के लिए अनुमति देता है कोशिका चक्र। Aphidicolin डीएनए पोलीमरेज़ α के एक अवरोध है, जो एस चरण 12 से 15 परमाणु डीएनए प्रतिकृति के लिए मुख्य पोलीमर्स है। mtDNA प्रतिकृति डीएनए पोलीमरेज़ γ, जो इलाज के aphidicolin के प्रति असंवेदनशील है द्वारा किया जाता है। इसलिए, पहले और edu ऊष्मायन के दौरान aphidicolin के साथ इलाज के लिए काफी परमाणु डीएनए में edu समावेश हिचकते हैं। यह होना चाहिएध्यान दिया जाना aphidicolin कई हफ्तों के लिए स्थिर हो सकता है कि यदि उचित रूप से संग्रहीत है, और परमाणु डीएनए प्रतिकृति में बाधा aphidicolin की प्रभावकारिता हमारे हाथ में चर रहा था। आगे डेटा से विश्लेषण करती है ovarioles या मजबूत परमाणु डीएनए लेबलिंग के साथ अंडा कक्षों बाहर रखा जाना चाहिए।
mtDNA प्रतिकृति आसानी से कोशिका द्रव्य है, जो भी edu puncta की संख्या, कोशिका द्रव्य की कुल मात्रा के लिए सामान्यीकृत की गणना के द्वारा mtDNA प्रतिकृति के स्तर यों के लिए एक सीधा रास्ता देता में puncta के रूप में देखे जा सकते हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सूक्ष्म छवियों, जो बड़े डेटा सेट के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है में edu puncta की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, सावधानियों, लिया जाना चाहिए, क्योंकि परमाणु डीएनए प्रतिकृति की अधूरी निषेध गुणसूत्र पर अलग-अलग स्थलों में edu समावेश करने के लिए नेतृत्व और नाभिक के अंदर puncta के रूप में प्रदर्शित कर सकते हैं। इसके अलावा अन्य मामलों में, edu की तीव्रता Repli में शामिलcating mtDNA, कमजोर हो सकता है, जबकि पृष्ठभूमि और शोर उच्च किया जा सकता है। इसलिए, स्वत: छवि विश्लेषण के लिए अलग-अलग मानकों को ध्यान से परिभाषित किया जाना चाहिए। यह भी सिफारिश की है कि छवियों को प्रशिक्षित आँखों से जांच की जानी चाहिए सुनिश्चित करें कि उचित edu puncta पहचान कर रहे हैं बनाने के लिए।
ड्रोसोफिला oogenesis दौरान नए संश्लेषित mtDNA के दृश्य की जांच करने के लिए कैसे mtDNA प्रतिकृति शारीरिक या रोग की स्थिति के तहत विनियमित है औषधीय या आनुवंशिक perturbations की एक किस्म के अधीन मक्खियों में प्रयोग बाहर ले जाने से, एक अवसर प्रदान करता है। Coi T300I 11: पिछले एक अध्ययन में, edu समावेश परख एक mtDNA उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला मीट्रिक टन में प्रदर्शन किया गया था। इसके अलावा, mitochondrial झिल्ली क्षमता को बाधित करने के लिए, अंडाशय mitochondrial uncoupler FCCP या 2,4-Dinitrophenol (DNP) से पहले edu के लिए समावेश के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। प्रायोगिक उद्देश्यों पर निर्भर करता हैऔर नशीली दवाओं के लक्षण, अलग अलग तरीकों का प्रभावी वितरण के लिए अपनाया जा सकता है। वयस्क मक्खियों के लिए, दवाओं एक वाष्प (जैसे, इथेनॉल और कोकीन) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता 16,17 या ड्रग्स पेट, जहां इसे जल्दी से शरीर 18 भर diffuses में इंजेक्ट किया जा सकता है। सबसे आम बात है कि दवाओं मक्खी भोजन या एक सूक्रोज / दवा संतृप्त फिल्टर पेपर के लिए जोड़ रहे हैं। उदाहरण के लिए, microtubule विधानसभा, colchicine के अवरोध, अंडाशय विच्छेदन 19 से पहले 2-3 दिनों के लिए मक्खियों को खिलाया गया था। इसलिए, यह दवा वितरण पद्धति का मूल्यांकन करने और उचित सांद्रता का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
ड्रोसोफिला अंडाशय में mtDNA प्रतिकृति के सफल इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से निष्पादित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, विच्छेदन और edu समावेश दौरान व्यवहार्यता और अंडाशय के स्वास्थ्य संरक्षण आवश्यक है (चरण 1 और 2)। FBS के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला मध्यम आरटी के लिए गरम करने की जरूरत हैइस्तेमाल से पहले। एक अंडा कक्षों और विदारक उपकरण या पिपेट सुझावों के बीच सीधे संपर्क को कम करना चाहिए। अंडाशय निर्जलीकरण से बचने के समाधान के तहत डूब जाना चाहिए हर समय। Mishandling ऊतकों आसानी से नेतृत्व कर सकते बेहोश या कोई फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए। ऊतक बढ़ते कदम के दौरान, ovarioles एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए और खुर्दबीन स्लाइड पर फैल गए। सुनिश्चित करें कि अंडा कक्षों के लिए एक दूसरे के ऊपर खड़ी नहीं कर रहे हैं। हमने देखा है कि मंच 14 परे अंडा कक्षों थोड़ा edu समावेश का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, बड़े आकार की वजह से, देर चरण अंडा कक्षों अक्सर पड़ोसी छोटे अंडे कक्षों ध्यान से बाहर होने का कारण। इस प्रकार यह सिफारिश की है कि देर से मंच अंडा कक्षों खारिज किया।
यहाँ हम लेबलिंग ड्रोसोफिला वयस्क अंडाशय में mtDNA नकल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि विभिन्न आनुवंशिक और औषधीय perturbations के तहत mtDNA प्रतिकृति की साधारण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है,और विकासात्मक mitochondrial biogenesis और mtDNA विरासत अंतर्निहित तंत्र विदारक के लिए उपयोगी हो जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |