ट्यूमर मेटास्टेसिस पर हाइपोक्सिया का परीक्षण प्रभाव के लिए vivo मॉडल में
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
इविंग सारकोमा (ते) एक आक्रामक बच्चों और किशोरों को प्रभावित करने द्रोह है। 1 ट्यूमर, मुलायम ऊतकों और हड्डियों में विकसित सामान्यतः अंगों में। जबकि मेटास्टेसिस की उपस्थिति ते रोगियों के लिए सबसे शक्तिशाली प्रतिकूल शकुन कारक है, तंत्र उनके विकास अंतर्निहित अस्पष्ट रहते हैं। 2 ट्यूमर हाइपोक्सिया ते प्रगति में फंसा कुछ कारकों में से एक है। ते रोगियों में, ट्यूमर के ऊतक के भीतर गैर-भरकर रखा क्षेत्रों की उपस्थिति गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। 3 इन विट्रो में, हाइपोक्सिया ES कोशिकाओं के invasiveness बढ़ जाती है और समर्थक मेटास्टेटिक जीनों की अभिव्यक्ति हो सके। 4-6 हालांकि, सबूत की इन पंक्तियों के बावजूद, हाइपोक्सिया प्रेरित ते प्रगति और प्रसार के लिए कोई सीधा सबूत मौजूद है। इसके अलावा, तंत्र है जिसके द्वारा हाइपोक्सिया डाल रही है इस तरह के प्रभाव होते हैं, वर्तमान में, अज्ञात है। इसलिए, हम vivo मॉडल बनाया है विट्रो डेटा और नैदानिक obser में मौजूदा बीच की खाई को भरने के लिएvations। इस मॉडल प्रणाली उनके प्राकृतिक वातावरण में होने वाली ट्यूमर पर हाइपोक्सिया के प्रभाव से प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए सक्षम बनाता है, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग ट्यूमर प्रगति और पूर्व vivo रोग और आणविक विश्लेषण (चित्रा 1) के साथ संयोजन में विवो में मेटास्टेसिस का पालन करें।
चूंकि ते की कोई स्थापित ट्रांसजेनिक मॉडल वर्तमान में उपलब्ध है, इन ट्यूमर के मेटास्टेटिक संपत्तियों पर vivo अध्ययन immunocompromised चूहों में मानव कोशिकाओं के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं। प्रतिरक्षा के बिगड़ा पशुओं के उपयोग रोग प्रगति पर प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रभाव को नजरअंदाज कर सकते हैं, वहीं मानव कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता इस तरह के अध्ययन के translatability बढ़ जाती है। विभिन्न मॉडलों के बीच जेनोग्राफ्ट, पूंछ नस में इंजेक्शन प्रणालीगत सबसे आसान प्रदर्शन कर रहे हैं, फिर भी वे ट्यूमर सेल intravasation की प्रारंभिक कदम न आना और विकास की प्राथमिक साइट से बचने। 7-12 दूसरी ओर, orthoto पिक xenografting है, जो हड्डियों (फीमर, रिब) या मांसपेशियों में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन शामिल है, और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन यह भी अधिक जैविक रूप से मानव कैंसर के लिए प्रासंगिक है। 13-16 मेटास्टेसिस विकास से पहले हालांकि, अतीत में, उच्च प्राथमिक ट्यूमर का तेजी से विकास के साथ जुड़े रुग्णता अक्सर जरूरी हो गया है पशु इच्छामृत्यु। इस अध्ययन में, हम gastrocnemius मांसपेशी एमआरआई द्वारा मेटास्टेटिक प्रगति के अनुदैर्ध्य निगरानी के साथ संयुक्त जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक ट्यूमर के छांटना के द्वारा पीछा में सेल इंजेक्शन के एक पहले से स्थापित मॉडल कार्यरत हैं। मांसपेशियों और हड्डियों – – 17,18 टिबिया के पास में gastrocnemius मांसपेशी में इस तरह के इंजेक्शन दो प्राकृतिक ते वातावरण में ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति देते हैं और स्थानों को आम तौर पर मानव में प्रभावित करने के लिए दूर के मेटास्टेसिस में परिणाम। 18 इस प्रकार, इस मॉडल सही रोग प्रगति दौरान ते रोगियों में होने वाली प्रक्रियाओं मेटास्टेटिक स्मरण दिलाता है।
तम्बू "> कम hindlimb में प्राथमिक ट्यूमर के स्थानीयकरण भी ट्यूमर के ऊतक को रक्त की आपूर्ति के सटीक नियंत्रण की सुविधा। और्विक धमनी बंधाव (फल) एक अच्छी तरह से स्थापित angiogenesis अनुसंधान में उपयोग के बाहर के क्षेत्रों के लिए रक्त के प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए तकनीक है पैर और इस प्रकार ischemia के जवाब में ऊतक vascularization की जाँच। 19,20 महत्वपूर्ण बात है, रक्त प्रवाह में प्रारंभिक बूंद जमानत के पोत उद्घाटन और ऊतक reperfusion मनाया लगभग 3 दिनों के बाद फल द्वारा पीछा किया जाता है। 20, जब एक ट्यूमर असर अंग में प्रदर्शन किया, इस मॉडल तेजी से बढ़ ट्यूमर में हाइपोक्सिया / reperfusion की घटनाओं है कि स्वाभाविक रूप से हो recreates और नए खुले जमानत के जहाजों के माध्यम से कम करने के लिए hindlimb छिड़काव की बहाली के कारण मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के भागने के लिए सक्षम बनाता है। 21 महत्वपूर्ण बात है, ट्यूमर के आकार है जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाना चाहिए काफी छोटा नियंत्रण ट्यूमर में अत्यधिक हाइपोक्सिया (आमतौर पर ट्यूमर असर बछड़ा खंड पर रोकने के लिए150 के ume – 250 मिमी 3), नियंत्रण और फल का इलाज समूहों के बीच ट्यूमर हाइपोक्सिया के स्तर में काफी अंतर को सुनिश्चित करने।ते विलंबता पर हाइपोक्सिया के प्रभाव और मेटास्टेसिस की आवृत्ति के अनुदैर्ध्य निगरानी के अलावा, इस मॉडल को भी ऊतकों के संग्रह और दोनों को प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस से नए सेल लाइनों के विकास के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, पिछले काम स्थापना की है कि मेटास्टेसिस व्युत्पन्न सेल लाइनों जानवरों के reintroduction पर बढ़ाया metastatic क्षमता का प्रदर्शन है, यह दर्शाता है कि ट्यूमर प्रसार ट्यूमर सेल phenotype में स्थायी बदलाव, और इस तरह इन सेल लाइनों का उपयोग मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं को समझने के लिए मान्य के साथ जुड़ा हुआ है। 18 सामूहिक रूप से, इन मॉडलों अब हाइपोक्सिया प्रेरित मेटास्टेटिक रास्ते की पहचान करने के लिए आवश्यक आनुवंशिक और आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
हाइपोक्सिया के रूप में एक समर्थक मेटास्टेटिक कारक विभिन्न टी के द्रोह बढ़ाने हैumors, हमारे मॉडल अन्य ट्यूमर प्रकार है कि स्वाभाविक रूप से अंगों में विकसित करने, ऐसे osteosarcoma और rhabdomyosarcoma के रूप में हाइपोक्सिया की भूमिका की जांच करने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 21-23 इसके अलावा, एक समान दृष्टिकोण रक्त की आपूर्ति की एक अच्छी तरह से परिभाषित मार्ग के साथ अन्य शारीरिक स्थानों में बढ़ रहा है कैंसर के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, मॉडल संशोधित किया जा सकता है और इसकी उपयोगिता आगे बढ़ाया, व्यक्तिगत अनुसंधान की जरूरत पर निर्भर करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे मॉडल दो प्रयोगात्मक समूहों में मेटास्टेसिस की तुलना शामिल है – एक नियंत्रण समूह, जहां ट्यूमर hindlimb 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा मात्रा पर पहुंचने पर विच्छेदन के द्वारा पीछा में विकसित करने के लिए अनु…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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