In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
יואינג סרקומה (ES) היא גידול ממאיר אגרסיווי המשפיע על ילדים ובני נוער. 1 הגידולים מתפתחים רקמות ועצמות רכות, בדרך כלל בגפיים. בעוד בנוכחות הגרורה הוא גורם מנבא שהלילי החזק ביותר יחיד לחולי ES, המנגנונים שבבסיס ההתפתחות שלהם עדיין אינם ברורים. היפוקסיה גידול 2 הוא אחד הבודדים גורמים מעורבים התקדמות ES. בחולי ES, בנוכחות באזורים שאינם perfused בתוך רקמת הגידול קשורה לפרוגנוזה גרועה. 3 במבחנה, היפוקסיה מגביר הפולשנות של תאי גזע עובריים ומפעיל הביטוי של גנים פרו-גרורתי. 4-6 עם זאת, על אף דבריו אלה של ראיות, אין הוכחה ישירה להתקדמות ES-induced היפוקסיה והתפשטות קיימת. יתר על כן, את המנגנונים שבאמצעותם היפוקסיה מחולל השפעות כאלה הן, לפי שעה, לא ידועים. לפיכך, יצרנו מודל in vivo כדי למלא את הפער בין הקיים בנתונים במבחנה obser קלינייםvations. מערכת מודל זה מאפשרת בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה על גידולים המתרחשים בסביבתם הטבעית, באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כדי לעקוב אחר התקדמות גידול וגרור in vivo בשילוב עם ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים vivo לשעבר (איור 1).
מאז אין מודל מהונדס הוקם של ES זמין כעת, מחקרי in vivo על תכונות גרורתי של גידולים אלה מסתמכים על זריקות של תאים אנושיים לעכברים בעלי דיכוי חיסוני. בעוד השימוש בבעלי חיים לקויים אימונולוגית שעלול להמעיט בהערכת ההשפעה של המערכת החיסונית על התקדמות המחלה, את היכולת להשתמש בתאים אנושיים מגבירה translatability של מחקרים כאלה. בין דגמי xenograft שונים, זריקות מערכתיות לתוך וריד זנב הם הקלים ביותר לביצוע, ובכל זאת היא להשמיט את השלבים הראשוניים של intravasation תאים הסרטני ולברוח מן האתר הראשי של צמיחה. 7-12 מצד שני, orthoto pic xenografting, אשר כרוך זריקות של תאים סרטניים לתוך העצמות (עצם הירך, צלע) או שרירי, הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית, אלא גם יותר ביולוגית רלוונטי סרטן אנושיים. עם זאת 13-16, בעבר, את התחלואה הגבוהה הקשורים צמיחה מהירה של גידולים ראשוניים יש חייבתה לעתים קרובות המתת חסד של בעלי חיים לפני ההתפתחות גרורה. במחקר זה, אנחנו עובדים מודל הוקם בעבר של זריקות תא לתוך שריר הסובך ואחריו כריתה של הגידול הראשוני שהתקבל בשילוב עם ניטור אורך של התקדמות גרורתי ידי MRI. 17,18 זריקות כאלה לתוך שריר סובך בסמיכות השוקה לאפשר את צמיחת גידול בשתי סביבות ES טבעיות – שרירים ועצמות – ולגרום גרורות מרוחקות למקומות בדרך כלל מושפעים בבני אדם. 18 ובכך, המודל הזה במדויק משחזר את התהליכים המתרחשים גרורתי בחולים ES במהלך התקדמות המחלה.
אוהל "> הלוקליזציה של גידולים ראשוניים של hindlimb הנמוך גם מקלה על השליטה המדויקת של אספקת הדם אל רקמת הגידול. קשירת עורק ירך (FAL) היא טכניקה מבוססת היטב מנוצלת במחקר אנגיוגנזה לחסום את זרימת דם לאזורים הדיסטלי של הרגל ולחקור כלי דם ברקמה בתגובה איסכמיה. 19,20 חשוב לציין כי הירידה הראשונית בזרימת דם ואחריו reperfusion פתיחה ורקמות כלי בטחונות נצפו כ 3 ימים לאחר FAL. 20 לפיכך, כאשר היא מבוצעת באיבר נושאות גידולים, מודל זה יוצר מחדש אירועים היפוקסיה / reperfusion הנמצא באופן טבעי גידולים שמתפתחים מהר ומאפשר הבריחה של תאים סרטניים עם גרורות עקב שיקום של זלוף אל hindlimb הנמוך באמצעות כלים בטחונות חדשות שנפתחו. 21 חשוב לציין, חייבת להתבצע בהליך זה כאשר גודל הגידול קטן מספיק כדי למנוע היפוקסיה מוגזם בגידולים מלאים (בדרך כלל בחלק כרך עגל נושאות גידוליםume של 150 – 250 מ"מ 3), הבטחת הבדלים משמעותיים ברמות של היפוקסיה גידול בין מלא קבוצות שטופלו FAL.בנוסף ניטור אורך של שפעת היפוקסיה על חביון ES ואת התדירות של גרורות, מודל זה מאפשר גם לאיסוף רקמות לבין ההתפתחות של שורות תאים חדשות משני גידולים וגרורים עיקריים. חשוב לציין, הוקמה עבודה קודמת כי שורות תאים שמקורם גרורות להפגין פוטנציאל גרורתי משופר על השבה לבעלי חיים, המציין כי הפצת גידול קשורה שינויים של קבע פנוטיפ התאים הסרטני, ובכך אימות השימוש של שורות תאים אלה להתחקות אחר התהליכים גרורתי. 18 קולקטיבי, המודלים האלה ניתן להשתמש כעת עבור ניתוחים גנטיים ומולקולריים הנדרש לזיהוי מסלולים גרורתי הנגרמת היפוקסיה.
כפי היפוקסיה הוא גורם פרו-גרורתי שיפור הממאיר של t השונהumors, המודל שלנו יכול לשמש כפלטפורמה לחקור את התפקיד של היפוקסיה ב סוגי גידולים אחרים המתפתחים באופן טבעי בגפיים, כגון אוסטאוסרקומה ו ראדומיוסרקומה. יתר על כן 21-23, גישה דומה ניתן להחיל על ממאירויות גדל במקומות אנטומיים אחרים עם מסלול מוגדר היטב של אספקת דם. בסופו של דבר, המודל יכול להיות משונה השירות שלה להאריך עוד יותר, בהתאם לצרכי מחקר בודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל שלנו כולל השוואה של גרורות בשתי קבוצות ניסוי – קבוצת ביקורת, שבהם גידולים מותרים להתפתח hindlimb ואחריו קטיעה בהגיעם נפח עגל של 250 מ"מ 3, וקבוצה חשופה-היפוקסיה, שבו tumor- hindlimb נושאות נתונה FAL באותו נפח, ואחריו קטיעה 3 ימים לאחר מכן. למרות בניסויים אלה הגידולים שט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
