В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Саркома Юинга (ES) является агрессивным злокачественности среди детей и подростков. 1 Опухоли развиваются в мягких тканей и костей, обычно в конечностях. В то время как наличие метастазов является наиболее мощным неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов ES, механизмы, лежащие в основе их развития остаются неясными. 2 Опухоль гипоксия является одним из немногих факторов , вовлеченных в ES прогрессии. У пациентов, ES, присутствие не-перфузию областей в ткани опухоли ассоциируется с плохим прогнозом. 3 В пробирке, гипоксия увеличивает инвазивность ЭС клеток и запускает экспрессию про-метастатических генов. 4-6 Тем не менее, несмотря на эти линии доказательств, нет прямых доказательств для гипоксия-индуцированного ES прогрессии и распространения не существует. Кроме того, механизмы, с помощью которых гипоксия оказывает такие эффекты, в настоящее время, неизвестно. Таким образом, мы создали модель в естественных условиях , чтобы заполнить пробел между существующими в пробирке данные и клинической obserдений. Эта модель система позволяет осуществлять прямое тестирование последствий гипоксии на опухолях , происходящих в их естественной среде, с помощью магнитно – резонансной томографии (МРТ) , чтобы следовать прогрессии опухоли и метастазирование в естественных условиях в сочетании с экс естественных условиях патологических и молекулярных анализов (рисунок 1).
Так как не создана трансгенная модель ES в настоящее время доступна, исследования в естественных условиях на метастатических свойств этих опухолей полагаются на инъекции человеческих клеток в иммунодефицитом мышей. В то время как использование иммунологически обесцененных животных может недооценивать влияние иммунной системы на прогрессирование заболевания, способность использовать человеческие клетки увеличивает переводимость таких исследований. Среди различных моделей ксенотрансплантатов, системные инъекции в хвостовую вену легче всего выполнить, но они опускают начальные этапы клеточного intravasation опухоли и уйти от основного сайта роста. 7-12 С другой стороны, orthoto ПИК ксенотрансплантации, которая включает в себя инъекции опухолевых клеток в кости (бедренной кости, ребра) или мышц, является более технически сложными, но и более биологически отношение к раку человека. 13-16 Тем не менее, в прошлом, высокая заболеваемость , связанная с быстрым ростом первичных опухолей часто требовали эвтаназии животных до развития метастазов. В данном исследовании мы использовали ранее установленную модель клеточных инъекций в икроножной мышцы с последующим удалением полученной первичной опухоли в сочетании с продольным мониторингом метастатической прогрессии с помощью МРТ. 17,18 Такие инъекции в икроножной мышцы в непосредственной близости к большеберцовой кости позволяют для роста опухоли в двух природных средах – ES мышц и костей – и в результате отдаленных метастазов в местах , как правило , пострадавших в организме человека. 18 Таким образом, эта модель точно повторяет метастатического процессы , происходящие у больных ES во время прогрессирования заболевания.
палатка "> Локализация первичной опухоли в нижней задней конечности также облегчает точное управление кровоснабжения ткани опухоли. бедренную артерию лигирование (FAL) является хорошо отработанной технологией используется в исследованиях ангиогенеза, чтобы блокировать приток крови к дистальных отделах нога и исследовать васкуляризации тканей в ответ на ишемию. 19,20 Важно отметить, что первоначальное снижение кровотока сопровождается залоговой открытия сосуда и реперфузии тканей наблюдается примерно через 3 дня после FAL. 20 Таким образом, когда выполняется в несущей опухоль конечности, эта модель воссоздает гипоксия / реперфузии события , которые происходят естественным образом в быстро растущих опухолей и позволяет вылету метастатических опухолевых клеток вследствие восстановления перфузии к нижней задней конечности через вновь открытые коллатеральные сосуды. 21 Важно отметить, что эта процедура должна быть выполнена , когда размер опухоли достаточно мал, чтобы предотвратить чрезмерное гипоксию в контрольных опухолей (как правило, на несущей опухоль телячьей Volумэ 150 – 250 мм 3), что обеспечивает значительные различия в уровнях опухоли гипоксии между контрольной и FAL-обработанных группах.В дополнение к продольной мониторинга влияния гипоксии на ES задержки и частоты метастазов, эта модель также позволяет осуществлять сбор тканей и развитие новых клеточных линий из обоих первичных опухолей и метастазов. Важно отметить, что предыдущие работы было установлено, что метастазы полученные из клеточных линий демонстрировать повышенную метастатический потенциал по реинтродукции животных, что свидетельствует о том, что распространение опухоли связано с постоянными изменениями в формировании опухолевого фенотипа клеток, и, таким образом, проверки использования этих клеточных линий расшифровывать процессов метастазирования. 18 Итак , эти модели теперь могут быть использованы для генетических и молекулярных анализов , необходимых для идентификации индуцированных гипоксией метастатических путей.
Как гипоксии является про-метастатического фактор повышения пагубность различных тumors, наша модель может быть использована в качестве платформы для изучения роли гипоксии в других типах опухолей, которые естественным образом развиваются в конечностях, такие как остеосаркома и рабдомиосаркома. 21-23 Кроме того, подобный подход может быть применен к злокачественных опухолей , растущих в других местах , с анатомическими четко определенного маршрута кровоснабжения. В конечном счете, модель может быть изменена, и ее полезность продлен, в зависимости от индивидуальных потребностей в области исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша модель предполагает сравнение метастаза в двух экспериментальных группах – контрольной группы, где опухоли разрешено развиваться в задней конечности с последующей ампутацией при достижении объема теленка 250 мм 3, и гипоксия-облученной группе, в которой tumor- подшипник задней …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
