In vivo modell for testing Effekt av hypoksi på tumormetastaser
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Ewing sarkom (ES) er en aggressiv kreft som påvirker barn og unge. 1 Svulstene utvikle seg i bløtvev og bein, vanligvis i lemmene. Mens tilstedeværelsen av metastaser er den mest kraftfulle negativ prognostisk faktor for ES pasienter, mekanismene bak utviklingen fortsatt uklare. 2 Tumor hypoksi er en av de få faktorer involvert i ES progresjon. I ES pasienter, er tilstedeværelsen av ikke-perfusert områder i tumorvevet assosiert med dårlig prognose. 3 In vitro øker hypoksi invasivitet av ES-celler og utløser uttrykk for pro-metastatiske gener. 4-6 Men til tross for disse linjene med bevis, finnes ingen direkte bevis for hypoksi-indusert ES progresjon og spredning. Videre er mekanismene som hypoksi utøver slike effekter finnes det i dag ukjente. Derfor har vi laget en in vivo modell for å fylle gapet mellom eksisterende in vitro data og klinisk dialektikkensjoner. Dette modellsystem muliggjør direkte testing av virkningen av hypoksi på tumorer som opptrer i sitt naturlige miljø, ved hjelp av magnetisk resonans imaging (MRI) for å følge tumorprogresjon og metastaser in vivo i kombinasjon med ex vivo patologisk og molekylære analyser (figur 1).
Siden ingen etablert transgen modell av ES er for tiden tilgjengelig, in vivo studier på metastatiske egenskaper av disse svulstene er avhengige av injeksjoner av humane celler i immunforsvar mus. Mens bruken av immunologisk svekkede dyr kan underestimere effekten av immunsystemet på sykdomsutvikling, muligheten til å bruke humane celler øker translatability av slike studier. Blant forskjellige xenograft modeller, systemiske injeksjoner i halevenen er lettest å utføre, men de utelater de første trinnene av tumorcelle intravasation og flykte fra den primære stedet for vekst. 7-12 På den annen side, orthoto pic xenografting, som involverer injeksjoner av tumorceller inn i bein (femur, ribbe) eller muskler, er mer teknisk krevende, men også mer biologisk relevant for kreft hos mennesker. 13-16 Men i det siste, høy sykelighet forbundet med rask vekst av primære svulster har ofte nødvendig dyr dødshjelp før metastaseutvikling. I denne studien vi benyttet et tidligere etablert modell av celle injeksjoner i gastrocnemius muskelen fulgt av fjerning av den resulterende primærtumor kombinert med langsgående overvåking av metastatisk progresjon av MRI. 17,18 Slike injeksjoner i gastrocnemius muskelen i umiddelbar nærhet til tibia tillate tumorvekst i to naturlige ES miljøer – muskler og bein – og føre til fjernmetastaser til steder vanligvis påvirket hos mennesker. 18 Dermed denne modellen rekapitulerer nøyaktig de metastatiske prosesser i ES pasienter under sykdomsprogresjon.
telt "> Lokaliseringen av primære tumorer i den nedre bakben letter også nøyaktig kontroll av blodtilførselen til tumorvevet. lårarterien ligering (FAL) er en veletablert teknikk som benyttes i angiogenese forskning for å blokkere blodstrømmen til fjerntliggende områder av benet og undersøke vev vaskularisering som respons på ischemi. 19,20 Viktigere, den innledende fall i blodstrømningen etterfølges av kollaterale åpning og vev reperfusjon observert ca. 3 dager etter FAL. 20 Således, når utført i en tumorbærende lem, denne modellen gjenskaper hypoksi / reperfusjonshendelser som forekommer naturlig i raskt voksende svulster og gir utslipp av metastatiske tumorceller på grunn av restaurering av perfusjon til lavere bakben via nyåpnede sivile fartøyer. 21 Viktigere, denne prosedyren må utføres når svulsten størrelse er liten nok til å hindre overdreven hypoksi i kontrolltumorer (vanligvis ved den tumor-bærende kalv volUme av 150-250 mm 3), noe som sikrer betydelige forskjeller i nivåene av tumor hypoksi mellom kontroll og FAL-behandlede grupper.I tillegg til langsgående overvåkning av effekten av hypoksi på ES latens og hyppigheten av metastaser, denne modellen gjør det også mulig for innsamling av vev, og utvikling av nye cellelinjer fra både primærsvulster og metastaser. Viktigere, tidligere arbeid fastslo at metastaser-avledede cellelinjer som oppviser forbedret metastatisk potensiale ved gjeninnføringen til dyr, noe som indikerer at tumorspredning er forbundet med permanente forandringer i tumorcelle-fenotype, og derved å validere anvendelse av disse cellelinjer for å dechiffrere de metastatiske prosesser. 18 Samlet kan disse modellene nå brukes for de genetiske og molekylære analyser som kreves for å identifisere hypoksi-indusert metastatiske veier.
Som hypoksi er en pro-metastatisk faktor styrke malignitet av ulike tumors kan vår modell brukes som en plattform for å undersøke rollen av hypoksi i andre tumortyper som naturlig utvikler seg i lemmene, så som osteosarcom og rhabdomyosarkom. 21-23 Videre kan en lignende tilnærming brukes på malignitet vokser i andre anatomiske steder med et veldefinert ruten for blodtilførsel. Til syvende og sist, kan modellen modifiseres og dens nytte ytterligere utvidet, avhengig av individuelle forskningsbehov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår modell innebærer sammenligning av metastase i to forsøksgrupper – en kontrollgruppe, hvor tumorer får lov til å utvikle seg i bakben, etterfulgt av amputasjon ved oppnåelse av en kalv volum på 250 mm3, og en hypoksi-eksponert gruppe, hvori tumor- bærende bakben utsettes for FAL på samme volum, etterfulgt av amputasjon 3 dager senere. Selv om det i disse forsøkene Fal-behandlede tumorer er amputert med en liten forsinkelse, som sammenlignet med kontrolltumorer, deres størrelse ikke øker i løpe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
