In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Ewing-Sarkom (ES) ist eine aggressive Krebserkrankung Kindern und Jugendlichen zu beeinträchtigen. 1 Die Tumoren entwickeln sich in Weichgewebe und Knochen, die üblicherweise in den Gliedern. Während das Vorhandensein von Metastasen für ES Patienten die einzige stärksten negativen prognostischer Faktor ist, bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Entwicklung unklar. 2 Tumorhypoxie ist eines der wenigen Faktoren in ES Progression beteiligt ist . In ES-Patienten wird das Vorhandensein von nicht-durchbluteten Bereichen innerhalb des Tumorgewebes mit einer schlechten Prognose verbunden. 3 In vitro erhöht Hypoxie Invasivität von ES – Zellen und löst die Expression von pro-metastatischen Gene. 4-6 Doch trotz dieser Beweislinien, keinen direkten Beweis für Hypoxie-induzierte ES Progression und Verbreitung besteht. Darüber hinaus sind die Mechanismen, durch die Hypoxie solche Wirkungen ausübt, sind derzeit nicht bekannt. Daher haben wir ein in vivo – Modell zu füllen die Lücke zwischen den bestehenden In – vitro – Daten und der klinischen Obser erstelltvationen. Dieses Modellsystem ermöglicht die direkte Prüfung der Wirkungen von Hypoxie auf Tumoren in ihrer natürlichen Umgebung auftritt, Magnetresonanz – Bildgebung (MRI) der Tumorprogression und Metastasierung in vivo in Kombination mit ex vivo pathologischen und molekularen Analysen (Abbildung 1) zu folgen.
Da keine etablierte transgenes Modell ES derzeit verfügbar ist, die in vivo Studien an metastatischen Eigenschaften dieser Tumoren beruhen auf Injektionen von menschlichen Zellen in immungeschwächten Mäusen. Während die Verwendung von immunologisch beeinträchtigt Tiere auf dem Fortschreiten der Krankheit, die Auswirkungen des Immunsystems unterschätzen können, erhöht die Fähigkeit, menschliche Zellen zu verwenden Translatierbarkeit solcher Studien. Unter den verschiedenen Xenotransplantatmodellen, sind systemische Injektionen in die Schwanzvene am einfachsten zu führen, aber sie lassen Sie die ersten Schritte der Tumorzelle intravasation und die Flucht aus dem primären Standort des Wachstums. 12.07 Auf der anderen Seite, orthoto pic xenografting, die Injektionen von Tumorzellen in Knochen (Femur, Rippe) oder Muskeln betrifft, ist technisch anspruchsvoll, aber auch mehr biologisch relevanten menschlichen Krebs. 13-16 jedoch in der Vergangenheit die hohe Morbidität mit raschem Wachstum von primären Tumoren ist oft notwendig Einschläferung vor Metastasierung Entwicklung. In dieser Studie verwendeten wir ein zuvor etabliertes Modell von Zellinjektionen in den Gastrocnemius-Muskel durch Exzision des resultierenden primären Tumors gefolgt mit Längs Überwachung des metastasierten Progression durch MRT kombiniert. 17,18 Solche Injektionen in gastrocnemius Muskel in der Nähe der Tibia erlauben für das Tumorwachstum in zwei natürlichen ES Umgebungen – Muskeln und Knochen – und in Fernmetastasen zu Orten führen in der Regel bei Menschen betroffen. Dadurch 18, ist dieses Modell rekapituliert genau die metastatische Vorgänge im ES Patienten während der Progression der Erkrankung.
Zelt "> Die Lokalisierung von Primärtumoren in der unteren hindlimb erleichtert auch die präzise Steuerung der Blutversorgung der Tumorgewebe. A. femoralis Ligatur (FAL) eine gut etablierte Technik, die in Angiogenese Forschung verwendet wird, ist der Blutfluss zu den distalen Regionen zu Block von das Bein und Gewebedurchblutung in Reaktion auf Ischämie untersuchen. 19,20 Wichtig ist , dass der anfängliche Abfall des Blutfluss wird durch Sicherheiten Gefäßöffnung und Gewebe Reperfusion beobachtet ca. 3 Tage nach FAL gefolgt. 20 wenn also in einem tumortragenden Glied durchgeführt, dieses Modell erschafft Hypoxie / Reperfusion Ereignisse , die natürlich in schnell wachsenden Tumoren und ermöglicht das Entweichen von metastasierenden Tumorzellen aufgrund Wiederherstellung der Perfusion an der unteren hinteren Gliedmaßen über neu eröffneten Kollateralen auftreten. 21 ist wichtig, dass dieses Verfahren durchgeführt werden , wenn die Tumorgröße ist klein genug, um eine übermäßige Hypoxie in Kontrolltumoren (typischerweise bei dem tumortragenden calf vol zu verhindernume von 150 bis 250 mm 3), signifikante Unterschiede in der Höhe der Tumorhypoxie zwischen Kontrolle und FAL behandelten Gruppen zu gewährleisten.Zusätzlich zur Längs Überwachung der Auswirkung der Hypoxie auf ES-Latenz und der Häufigkeit von Metastasen dieses Modell ermöglicht auch die Sammlung von Geweben und die Entwicklung neuer Zelllinien von sowohl primären Tumoren und Metastasen. Wichtig ist, dass festgestellt früheren Arbeiten, dass Metastasen abgeleiteten Zelllinien bei Wiedereinführung an Tiere verbessert metastatischen Potential aufweisen, was darauf hinweist, dass die Tumorausbreitung mit dauerhaften Veränderungen in der Tumorzelle Phänotyp assoziiert ist, und dadurch die Verwendung dieser Zelllinien Validierung der metastatischen Prozessen zu dechiffrieren. Insgesamt 18 Diese Modelle können nun für die genetische und molekulare Analysen zur Identifizierung von Hypoxie-induzierte metastasierendem Wege erforderlich verwendet werden.
Da Hypoxie ist ein Pro-metastatischen Faktor die Bösartigkeit verschiedener t Verbesserungumors, unser Modell kann als Plattform genutzt werden, um die Rolle von Hypoxie in anderen Tumorarten zu untersuchen, die von Natur aus in den Gliedern, wie Osteosarkom und Rhabdomyosarkom entwickeln. 21-23 Darüber hinaus kann ein ähnlicher Ansatz zu Malignitäten mit einer gut definierten Weg der Blutversorgung wächst in anderen anatomischen Stellen aufgebracht werden. Letztlich kann das Modell modifiziert und ihre Nutzbarkeit weiter ausgebaut werden, je nach individuellen Forschungsbedarf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Modell beinhaltet den Vergleich von Metastasen in beiden Versuchsgruppen – eine Kontrollgruppe, wo Tumoren erlaubt sind in der hinteren Gliedmaßen durch Amputation bei Erreichen eines Kalbes Volumen von 250 mm 3 und eine Hypoxie-exponierten Gruppe gefolgt zu entwickeln, in dem die Tumor- Lager hindlimb wird bei gleichem Volumen zu FAL unterworfen, die später von Amputations 3 Tage gefolgt. Auch wenn die FAL-behandelten Tumoren in diesen Experimenten mit einer leichten Verzögerung amputiert werden, zu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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