Protocol
Bu çalışma Singapur Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (onaylanan protokole hayır. R15-0225) Ulusal Üniversitesi ile uyumludur.
Hayvan Modeli 1. Cerrahi Hazırlık
- Gemi kanülasyonlar
- Erkek bir Sprague-Dawley sıçanları anestezi - ağırlığında (6 7 haftalık), (203 ± 20) intraperitonal yoluyla ketamin (37.5 mg / ml) ve ksilazin (5 mg / ml) kokteyli ile gr (ip) enjeksiyonu (2 ml / kg) . İğneyi tekrarlamak ya da enjeksiyondan sonra şırınga çıkarmayın.
- hayvana anestezi yapıldıktan sonra (kıstırma ayak ile teyit), 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin. Yavaşça skapula, ön serviks, alt karın, medial arka bacak ve skrotal kese saç tıraş. Yavaşça yapışkanlı kağıt bantlar kullanarak bacakları dizginlemek.
- Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps ile izlerken kullanarak tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirinBir stereomikroskop. Ameliyat sırasında yaralanmayı önlemek için delinmeye karşı dayanıklı bir tepsiye tüm keskin cerrahi aletler yerleştirin.
- kesi yapmadan önce tüm cerrahi siteleri alternatif iyot ve% 70 alkol ile 3 kez fırçalayın. 30 IU / ml heparin tuzlu su çözeltisi ile tüm kateterler yıkayın.
- Sağ juguler ven üzerinde cerrahi makas kullanarak skapula üzerinde 1,5 cm orta hat cilt kesi - 1 yapın. juguler ven ortaya çıkarmak için künt diseksiyon ile fasya ayırın ve bir polietilen tüp (PE-50) 5-0 ipek sütür kullanılarak heparin tuzlu su ile dolu olan cannulate. Yan anestezi infüze gerektiğinde (1/3 başlangıç dozunun 1/2, damar içine (IV)) cerrahi ve deney süresince.
- havayolu açıklığını korumak için trakeostomi gerçekleştirin. anterior servikal bölgede 1,5 cm kesi - 1 yapın. yerine kateteri sabitlemek için 2-0 ipek dikişlerle bir polietilen tüp (PE-205) kullanılarak trakea cannulate.
- Kan basıncını izlemekFemoral arter kanülasyonu yoluyla. arka bacak sol medial yüzeyi 1.5 cm'lik kesi - 1 yapın. künt diseksiyon ile femoral arter ayırın. heparin tuz çözeltisi 5-0 ipek sütür kullanılarak doldurulmuş bir polietilen boru (PE-10), femoral arter kanüle.
- Cremaster kas Hazırlama ve Akış Görselleştirme
- bunu genişletmek için skrotal kese apeks yoluyla 5-0 ipek sütür yerleştirin. skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapmak. maruz kas, düzenli sıcak izotonik solüsyonu (pH 7.4 37 ° C) uygulanır.
- dikkatle ve iyice bağ dokuları çevreleyen pamuk uçlu aplikatör kullanarak kaldırın.
- cremaster kas apeks yoluyla 5-0 ipek sütür yerleştirin. aynı uzunluktaki iki parçaya dikiş kesin ve her iki tarafta bir düğüm. İki düğüm arasındaki kas kesin ve hafifçe dikiş çekerek özelleştirilmiş şeffaf pleksiglas platformu üzerine germek. düzeltmekmavi yapışma ile platform üzerine sütür sonu.
NOT: bağ dokuları çevreleyen iyice çıkarılması optimum görüntü kontrastını elde önemlidir. - 5 ila 6 tespitler yapılana kadar adımı tekrarlayın 1.2.3. Dikkatle yüksek sıcaklık koter kullanılarak Epididimden cremaster kasını çıkarın. doku kaybını önlemek için maruz kas sıcak izotonik Superfuse.
- gazlı katlanmış parçalar ile cremaster kasını Surround. polivinil film ile maruz kas örtün. Film ile gazlı bez parçaları su daldırma mikroskop objektif (Şekil 1A) için sıcak izotonik çözüm tutmak için sığ bir havza oluşturur.
- Intravital mikroskobu (Şekil 1C) hayvan sahneye hayvan aktarın. Sürekli basıncı izleme (Şekil 1E) için fizyolojik bir veri toplama sistemine arteriyel kanülasyon bağlayın.
- kas temperat korumakHayvan platforma (Şekil 1B) altındaki bağlı bir ısıtma elemanı ile 35 ° C 'de ure. Isıtma elemanı (Şekil 1D) güç kontrolörü negatif geribildirim sağlamak için kas yanında bir sıcaklık probu yerleştirin.
- 15 dk çevre ile dengelenmesi için sahnede hayvan bırakın.
- 40X su daldırma objektif ve uzun çalışma kondansatör ile bir intravital mikroskop altında kan akışını gözünüzde canlandırın.
- dallanmamış arteriolden RBC çekirdek arasında net bir görüntü odak ve kontrast dayalı (<60 mikron) seçin, CFL ve damar duvarları, sırayla kan damarı çap düzleminde mikroskop odaklanmak. dikey damar duvarını hizalamak için mikroskop üzerine monte kamera döndürün.
- 1 saniye 3000 / sn kare hızında yüksek hızlı video kamera kullanılarak kan akışını kaydedin. görüntü kalitesini korumak için sıkıştırılmamış 8-bit gri tonlama AVI biçimi olarak kaydedilen video kaydedin.
NOT: / Sn 3.000 kare en az kayıt hızı flüoresan ölçümü fizyolojik arteriolar akış koşulları altında en az bir defa her RBC ile gerçekleştirilebilir sağlamak için önerilir. - Eritrosit ve plazma arasındaki kontrastı arttırmak için 510 nm - 310 394 nm ve spektral bandpass dalga boyunda tepe şanzıman ile mavi filtre kullanın.
NOT: mikroskobik ışık kaynağı (100 W halojen lamba) mavi filtreden geçen ışık spektrumu herhangi bir potansiyel doku hasarı önlemek için düşük ışık yoğunluğu olduğundan emin olun. - Deneyin sonunda, pentobarbital sodyum, aşırı dozda hayvan euthanize.
2. Görüntü Analizi
- Flüoresan genişliği ölçümü için Ön işleme
- MATLAB açın ve 'CFL_pre.m' dosyasını çalıştırın. (Bu ve diğer MATLAB dosyaları bulunabilirip "> Yan MATLAB Arşivi.)
- analiz etmek, video dosyasını seçmek için 'Açık dosya' tıklayın.
- dikey damar duvarları hizalamak için 'rotasyon' sürgüsünü ayarlayın.
NOT: Kullanıcılar 'Izgara On' radyo düğmesini seçerek damar uyum için yardımcı ızgara çizgileri görüntüler ve 'Zoom' kaydırıcıyı kaydırarak görüntüyü yakınlaştırma düzeyini ayarlayabilirsiniz. - damar uyumu onaylamak için 'Onayla Düzenlenmesi' butonuna tıklayın.
- Faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak için 'Set ROI ekine' butonuna tıklayın. hizalanmış görüntü bir pop-up penceresi görüntülenir. görüntü üzerinde dikdörtgen hedefi ayarlayın ve çift ROI onaylamak için tıklayın. Görüntünün kırpma gerekli değilse bu adımı atlayın.
NOT: Sadece gemiden CFL genişliği analiz etmek ROI tek bir gemi bulunmaktadır. Gerekirse, orijinal forma görüntüyü geri yüklemek için 'Reset Resim' düğmesine tıklayın. - Tıkla9; '(bmp' biçiminde ardışık bit haritası görüntüleri 8-bit gri tonlama) içine tüm düzenlenmiş video kareleri ayıklamak için düğmeye 'Images ayıklayın. çıkarılan görüntüler seçilen video dosyası ile aynı adı taşıyan klasörde bulunabilir.
- Flüoresan genişliğinin ölçümü
- MATLAB açın ve 'CFL_measure.m' dosyasını çalıştırın.
- çıkarılan görüntüleri içeren klasörü seçmek için 'Klasör seç' seçeneğini tıklayın.
- görüntüleri içeren klasöre tıklayın ve 'Klasör seç' seçeneğini tıklayın. klasördeki ilk görüntü karesi yüklenen ve 'Resim Histogram' panelinde gri yoğunluk Histogram ile birlikte, 'Gri tonlama görüntü' panelinde gösterilir.
- analizi, aksi takdirde ilk görüntü karesi seçilecektir gerçekleştirmek için liste kutusundan istenen görüntü çerçevesini seçin.
- yerde belirlenir görüntüde, iç damar duvarını tanımlamak için 'Gemi Duvarlar Bul' tıklayın neredekaranlıktan ışık yoğunluğu profil tepe transit iki piksel üzerinde ışık.
- 'Tuz ve biber' gürültüyü azaltmak için görüntüye medyan filtre uygulamak için 'Medyan Filtre' kontrol edin.
- görüntü kontrastını arttırmak için dijital görüntü yoğunlukları ayarlamak için 'Otomatik Kontrast' kontrol edin.
- τ üzerinde gri düzeyleri (CFL) ve τ altında gri düzeyleri (RBC çekirdek) siyah pikseller beyaz piksel - iki sınıfa gri düzeyleri böler otomatik olarak bir eşik değeri (τ) belirleyen liste kutusunda bir eşik algoritmasını seçin.
NOT: Otomatik-eşikleme algoritması hiçbiri uygun bir görüntü eşikleme sağlıyorsa alternatif bir yöntem olarak, manuel eşikleme kullanın. 'Elle' radyo düğmesini tıklayın ve manuel eşikleme değeri tanımlamak için kaydırma çubuğunu ayarlayın. - (Çözünürlük, CFL genişlikleri mekansal değişimini ölçen 'piksel çözünürlük' kutusuna piksel çözünürlüğünü girmek içinBu deney düzeneği ile 0.42 mm / piksel) idi.
- CFL genişlikleri mekansal değişimi elde etmek için 'Hesapla' düğmesine tıklayın. bir tablo formatında CFL genişliği veri vermek için 'İhracat .csv tıklayın.
- kare hızı bilgilerini, geminin boyunca belirli bir analiz hattında CFL genişlikleri zamansal değişimini ölçen 'Temporal Varyasyonu' radyo düğmesini tıklayın ve girmek için (bu deney düzeneği kullanılan kare hızını 3000 kare / sn idi).
- sırasıyla, 'Frame başlat' ve 'Son Frame' kutulara ilk kareyi ve analiz için görüntülerin son karesini girin.
- 'Analiz Line' kaydırma çubuğunu kaydırarak geminin boyunca analiz hattının pozisyonunu seçin. 'Grayscale görüntü' ve 'İkili görüntü' hem gösterilmiştir analiz hattının, konumunu onaylayın.
- CFL genişlikleri zamansal değişimini elde etmek için 'hesapla' tıklayın. click 'İhracat .csv' bir tablo formatında CFL genişliği veri vermek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo CFL görselleştirme hayvanın cerrahi hazırlıkları büyük ölçüde bağlıdır. Aşırı kan kaybı ya da genişletilmiş cerrahi süresi şok ve kan akımı sapmaları hayvan tabi olabilir. bir ısıtma yastığı yanı sıra cerrahi ve deney sırasında özelleştirilmiş bir platformu kullanarak doku sıcaklığı bakım da sıçan fizyolojik koşulları sağlamak için önemlidir. mikroskop sistemi bir 100 W halojen lamba kullanarak, hiç bir farkedilebilir doku hasarı da deneyin sonunda gözlemlenmiştir.
Şekil 2A, flüoresan RBC çekirdek ve iç damar duvarı (Şekil 2C) değiştiği gözlenen sıçan cremaster kasında dallanmamış arteriol, ile tipik bir RBC akışını göstermektedir. Deney sırasında bu bileşenler arasında iyi bir kontrast CFL genişliği ölçümlerin doğruluğunu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Görüntü analizinin ilk aşaması içerirİç damar duvarına tespiti. Geminin dik analiz hattı boyunca ışık yoğunluğu profili satın alarak, konum koyu gelen transit iki piksel (Şekil 2B) üzerinde ışık o zirvesinde yaklaşılır.
Eritrositler ve CFL farklı ışık geçirgenliği sahip olarak, gri düzeyleri arasındaki fark iki sınıf (ikili görüntü) ayrılabilir. Ancak, görüntü histogram iki zirveleri arasında doğru bir eşik değerinin belirlenmesi kötü görüntü kalitesi ve kontrast (Şekil 3A) tarafından kısıtlanmış olabilir. Mavi filtre kullanılabilir RBCs ve CFL, (Şekil 3B) arasındaki kontrastı arttırmak için. Bu, RBC çekirdek sınırları daha doğru mavi bir filtre kullanımı ile tespit edilebilir, Şekil 4'te de bellidir. Ayrıca, eşikleme algoritması 20-23 seçimi de CFL genişliği ölçümü etkileyebilir (Şekil4). Farklı eşikleme algoritması, tanımlanan farklı RBC çekirdek sınırında sonuçlandı Şekil 4A açıktır ki olabilir hatalı CFL ölçümlerine yöneltebilir. Daha iyi Şekil 4B'de flüoresan genişliği ölçümü eşik algoritması etkisini göstermek için, farklı eşik algoritmaları kullanılarak elde flüoresan genişliklerine mekansal profilleri Şekil 5'te gösterilmektedir ve Tablo 1 'de özetlenmiştir.
. Şekil 1:. Intravital Mikroskobik Sistemi ve Cremaster'ın kas Hazırlık A:. Cerrahi batın sıçan cremaster kas B: cremaster kasını yerleştirerek ve 35 ° C C'de sıcaklığını muhafaza etmek için ısıtma elemanları ile Özelleştirilmiş platformu: cus ile mikroskobik sistemiSürekli basınç kontrolü için fizyolojik veri toplama sistemi. Negatif geri besleme sıcaklık kontrolörü ve güç kaynağı E:. cremaster kas D mikrosirkulasyonu kan akışlarının görünüm için hayvan sahne ve yüksek hızlı kamera isteğe uyarlanabilen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:.. Bir arteriole RBC akışı tipik gri tonlamalı görüntü (damar çapı = 52 mm) B: Analiz hattı boyunca Işık yoğunluğu profili (Panel A düz çizgi) Gemi Duvar Pozisyonu ve CFL Genişlik A Belirlenmesi Görüntü İşleme c.: tekne üzerinde flüoresan ölçümü Örnek sonucu.Katı ve kesikli oklar sırasıyla RBC çekirdeğinin iç damar duvarını ve dış kenarını gösterir. (LWB ve RWB: sol ve sağ damar duvarı sınır, LCB ve RCB: sol ve sağ RBC çekirdek sınırı) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:.. Optik Mavi Filtresi ile Görüntü Kontrast (A) olmadan ve mavi filtre (B) elde edilen gri tonlu görüntüleri Görüntü histogramı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Figüre 4:.. (: mavi filtresi olmadan, alt satır (B): mavi filtreli Üst sıra (A)) kullanılarak RBC Çekirdek Genişliği Beş Farklı Eşik Algoritmalar RBC çekirdek ve Şekil 3'te gri tonlama görüntülerde üst üste damar duvarının Sınırları kullanılarak belirlenir Otsu yöntemi, asgari yöntemle, intermode yöntemi iteratif seçim yöntemi (Isodata) ve bulanık entropik eşikleme (Shanbhag) (soldan sağa). Katı ve kesikli çizgiler iç damar duvarı ve RBC çekirdeğinin dış kenarını işaret sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: flüoresan Genişlik uzaysal değişimini solunda 4B Şekil gelen flüoresan genişlikleri (A).ve sağ (B) damar duvarları, sırasıyla. (D: damar çapı mesafe) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Şekil 5. * p <0.001 Eşik Değerler ve CFL Genişliği Veri: Otsu yönteminden anlamlı fark. † p <0,001: Soldan anlamlı fark. İstatistiksel analizler, iki kuyruklu eşleştirilmemiş t-testler kullanılarak yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFL genişlik ölçüm mikrosirkülasyonun hemodinamik daha iyi anlaşılması için önemlidir. Özel olarak, flüoresan genişlikleri ölçümü mezenterik 6'da gerçekleştirilmiştir, 24 ve serebral 25 mikrodolaşımını spinotrapezius. In vivo flüoresan genişlikleri geleneksel ölçüm kaydedilen video çerçevelerinin elle muayene ile tahminlerine sınırlandırılmıştır. Manuel ölçümler görsel RBC çekirdek ve damar duvarlarının 15,16 sınırlarını belirleme önce birkaç ardışık video kareleri ortalamasını gerekli. Bir başka çalışmada, flöresin izotiyosiyanat (FITC) eritrositlerde etiketli ve rodamin B izotiyosinat (RITC) etiketlenmiş plazma kedi serebral mikrodamarlar 25 ortalama flüoresan genişlikleri belirlemek için kullanıldı. Bu önceki ölçüm yöntemleri çok zaman alıcı ve CFL wi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sınırlar floresan etiketleme için ek adımlar gerektirirDTH ölçümü. Buna karşılık, etkili bir görüntü segmentasyonu ve analiz, yüksek hızlı kamera kayıtları bağlanmasıyla, burada gösterdiği teknik küçük bir eritrosit ve boyutundan daha bir düzenin bir uzamsal çözünürlük (0.42 mikron) ile CFL Spatiotemporal varyasyon miktarının izin 1 / 3.000 sn zamansal çözünürlük.
cremaster kası düzgün Cerrahi hazırlık flüoresan genişliği ölçümlerin doğruluğunu belirlemede kritiktir. Özel olarak, bitişik bağ dokularının ayrıntılı çıkarma cremaster kas arteriyoller iyi bir odak sağlamak için gereklidir. Buna ek olarak, ölçüm zamansal ve uzamsal çözünürlük mikroskop ve kamera özelliklerine bağlıdır. Daha fazla büyütülmüş bir amacı, uzaysal çözünürlüğü geliştirmek de, bu da flüoresan genişliği uzaysal değişimini ölçülmesi için elde damar uzunluğu sınırlayan görüş alanını azaltır. Bu nedenle, microscopiCı konfigürasyonları tekniğin belirli bir uygulamaya göre değiştirilebilir.
Görüntü bölütleme CFL genişliği ölçüm doğruluğu için bir başka önemli faktördür. geliştirilen çeşitli teknikler arasında, gri seviye histogram dayalı görüntü eşikleme görüntü segmentasyonu ve analiz için basit ve etkili bir yaklaşım sağlar. Buna göre, ön plan nesneler gri düzeylerindeki fark esas alınarak arka plan çıkarılır. İdeal durumda, görüntü histogram bimodal olacak ve vadinin dibinde bir eşik değeri önemsiz olduğunu. Ancak, in vivo deneysel görüntüler hep böyle gri tonlama düzeyini profilleri göstermezler. Bizim sonuçları görüntü kalitesi ve kontrast görüntü bölütleme işlemini nasıl etkileyebileceğini göstermiştir. Bir optik mavi filtre kullanımı önemli ölçüde (Şekil 3) eritrosit ve arteriole plazma arasındaki kontrastı geliştirilmiş ve kurmuyorum zaman gerekli gibi görünüyorg ne olursa olsun algoritmalar (Şekil 4) CFL genişliği ölçümü için histogram tabanlı eşikleme. Bu tek etkili eşik değerini belirlemenizi sağlar ayrı bir bimodal görüntü histogram, sonuçlanır. Ancak, da in vivo görüntülerden elde edilen iki modlu bir histogram ile, iki adet tepe noktasına (yerel maksimum) son derece eşit varyans histogramın bir vadi (yerel minimum) de eşik noktası (Tablo 1 etkileyebilir unutulmamalıdır ). Bu nedenle, uygun bir eşikleme algoritması seçimi incelenen görüntü kalitesine göre gereken ve kullanıcıların CFL genişlikleri miktarının en uygunluğu için her eşikleme algoritması sınırlamaları göz önünde bulundurmanız gerekir.
Flüoresan genişlikleri akış şartları büyük ölçüde bağımlı olduğu için, deney süresince sürekli olarak kan basıncı ölçümü gereklidir. Yerel akış koşullarının belirlenmesi amacıyla,Kan akış hızı pseudoshear kan damarı 5 ortalama akış hızı ölçülerek hesaplanır.
Özet olarak, bir fare cremaster kas ve burada tarif edilen kantitatif resim analizi cerrahi hazırlanması için protokoller, in vivo olarak flüoresan genişlikleri dinamik varyasyon sayısal bilgiler elde etmek için kullanılmıştır. CFL genişliği ölçümlerin doğruluğunu sağlamada birincil sorunlar yukarıda ele alınmıştır ikisi de kas ve görüntü segmentasyonu, uygun cerrahi hazırlanmasını içermektedir. Bu teknik hali hazırda hemoreolojik ve çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda hemodinamik sapmaları araştırmak için diğer mikro dolaşım çalışmalara uyarlanabilmektedir. Sonuç olarak, bu bulgular mikrovasküler tedavi yaklaşımları ve klinik müdahale gelecekteki gelişimine katkıda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
- Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
- Goldsmith, H. L.
- Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
- Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
- Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
- Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
- Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
- Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
- Maeda, N.
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
- Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
- Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L.
- Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
- Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
- Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
- Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).
