Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
Sekundäre Stengelwachstum in den Bäumen und die damit verbundenen Holzbildung sind signifikant sowohl von biologischen und wirtschaftliche Perspektiven. Jedoch relativ wenig über die molekularen Kontrolle bekannt, die ihre Entwicklung steuert. Dies ist zum Teil aufgrund physikalischer, Ressourcen- und Zeitbegrenzungen oft mit dem Studium der sekundären Wachstumsprozessen in Verbindung gebracht. Eine Reihe von in – vitro – Techniken verwendet wurden , sowohl in der holzigen und nicht holzigen Pflanzenarten entweder Pflanzenteil oder ganze Pflanze System beteiligt sind . Jedoch Fragen über ihre Anwendbarkeit für die Untersuchung der Nebenschaftwachstumsprozesse, die Widerspenstigkeit bestimmter Arten und Arbeitsintensität sind oft unerschwinglich für mittlere bis hohe Durchsatzanwendungen. Auch wenn an Nebenschaft Entwicklung und Holzbildung suchen die spezifischen untersuchten Merkmale könnten nur messbar werden spät in einem Baum des Lebenszyklus nach mehreren Jahren des Wachstums. In diesen Herausforderungen Alternative in vivo p Adressierungrotocols wurden entwickelt, mit dem Namen Induced Somatic Branchenanalyse, die die Schaffung von transgenen somatischen Gewebe Sektoren direkt in der Anlage Nebenschaft einzubeziehen. Das Ziel dieses Protokolls ist eine effiziente, einfach und relativ schnell Mittel zur Verfügung zu stellen transgene sekundären Pflanzengewebe für Gen und Promotor funktionelle Charakterisierung zu erstellen, die in einer Reihe von Baumarten verwendet werden können. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass transgene Nebenschaft Sektoren in allen lebenden Geweben und Zelltypen erstellt werden, in der Sekundär einer Vielzahl von Baumarten stammt, und dass Holz als auch morphologische Merkmale als Promotor-Expressionsmuster in sekundären leicht mittel bis hoch eingeschätzt werden können Stiele erleichtern Durchsatz funktionelle Charakterisierung.
Introduction
Baum stammt eine erhebliche Menge der Planeten Biomasse umfassen und sind von immenser biologische, kulturelle und wirtschaftliche Bedeutung. Sekundäre Stielen Lebensraum schaffen, indem sie Ressourcen und Schutz für viele andere Lebensformen bieten. Sie liefern viele andere Dienstleistungen für die Ökosysteme, die sie bewohnen und wirken als nachwachsender Rohstoff für die Produktion von Holz, Zellstoff und Papier und andere Holz- und Nichtholzprodukten. Nebenschaft Entwicklung und insbesondere Holzbildung von komplexen molekularen System geregelt wird, das die Entwicklung von spezifischen Zelltypen, die biochemische Zusammensetzung ihrer Zellwände regulieren und wie sie angeordnet sind Gewebe und Organe zu bilden. Sezieren die molekulare Basis von Sekundärstammentwicklung und Holzbildung wird von vielen Faktoren ab, einschließlich der Variabilität von Holz und Stamm Eigenschaften verwechselt innerhalb und zwischen den Stämmen, lange Generationszeiten, out-Kreuzung Paarungssysteme, hohe Heterozygotie, hohe genetische Belastung, saisonale dormancy, lange reifenMerkmal Einrichtung Zeiten und die schiere physische Größe von ausgewachsenen Bäumen. Als Ergebnis, das Verständnis der Nebenschaft Entwicklung in Bezug auf die genaue Kenntnis der meisten anderen Aspekte der molekularen Kontrolle der Pflanzenentwicklung, ist immer noch in den Kinderschuhen.
Eine Reihe von in vitro – Techniken verwendet wurden Nebenschaft Entwicklung, insbesondere Holz und sekundären Zellwandbildung zu untersuchen und zu verstehen. Diese Protokolle umfassen die Verwendung von ganzen Pflanze oder der Pflanzenteil Systemen, bei denen entweder transgene Pflanzen erzeugt werden oder spezifische Sekundärzellen oder Gewebe werden für die Untersuchung von spezifischen Aspekten der Holz transformiert und / oder sekundären Schaft Entwicklung 1. Transgene Pflanzen können Post genetische Transformation aus einer Vielzahl von Pflanzengeweben und Zelltypen jedoch wiederhergestellt werden, geht nur langsam voran, vor allem, wenn Züge Holzfasern aufgrund der langen Regenerations Analyse und Reifezeiten stammen (in der Größenordnung von Jahren), hohe technische und Arbeits demands, geringen Durchsatz von Kandidatengenen sowie Schwierigkeiten in einigen holzigen Pflanzenarten. Ähnliche Techniken wurden in nicht-holzigen Modellsystem wie Arabidopsis entwickelt , die erfolgreich einige dieser Einschränkungen zu überwinden, aber nicht alle sekundären Typen Stammzelle eine in diesen Stämmen und Eigenschaften der Saisonalität oder Langlebigkeit selbst können nicht in einer solchen Art 2 untersucht werden. Alternativ Anlagenteilsysteme, wie Pinu s radiata Kalluskulturen 3 die damit verbundenen Fristen zu reduzieren. Diese Verfahren sind jedoch auf die Untersuchung eines einzelnen Zelltyp beschränkt und leiden ähnliche Einschränkungen wie für in vitro Versuche festgestellt. In ähnlicher Weise wurden apikal Stammkulturen 4 beteiligt ganze Stamm Explantate gezeigt Versprechen , aber noch nicht für die Untersuchung spezifischer Gene oder Promotoren von Interesse angewendet wurden. In jüngster Zeit ist ein alternatives Protokoll Haarwurzelkulturen beteiligt hat für Eucalypten und wurde erfolgreich entwickelt5 angelegt, wobei dieses Verfahren beinhaltet jedoch in vitro – Kultivierung erfordert immer noch, eher zweitrangig Wurzeln als Stämme und es ist auf einer einzigen Baumart zu datieren.
Induzierte somatischen Sektoranalyse (IVSS), wurde wie hier beschrieben, entwickelt eine mittlere bis hohe Durchsatz funktionelle Screening-Tool, einige dieser Probleme zu überwinden, für Gene und Promotoren mit Verdacht auf Rollen in Holzbildung und Nebenschaftgewebe Entwicklung. ISSA ist ein in vivo – Transformation und Screening – System , das entwickelt wurde , um die Zeit zu reduzieren , genommen , um transgene Zellen und Gewebe in einem intakten sekundären Schaft erzeugen , während Arbeits überwinden, technischen und Durchsatzbeschränkungen von routinemßig in vitro – Methoden verwendet. Die Protokolle hier beschrieben ermöglichen die gleichzeitige Schaffung von Hunderten von unabhängig transformierten Gewebe Sektoren und Zellen in sekundären innerhalb einer kurzen Zeit stammt, in der Baumarten und Gewebe von Interesse ohne genetic und / oder Umweltvariation innerhalb relativ kurzer Zeitrahmen und niedrigen Arbeitskosten. IVSS in – vivo – Techniken wurden zunächst für Sekundär Schaft 6 und Knospe 7 Gewebe beschrieben und seitdem in Nebenschaftgewebe durch Studien von Genen und / oder Promotoren in cambial Differenzierung beteiligt verfeinert worden und umfassen: Tubulin (TUB) 8, Fasciclin artigen Arabinogalactan ( FLA) 9, Cellulose – Synthase (CESA) 10, sekundäre Zellwand-assoziierten nac Domain (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 und wirklich interessante neue Gen (RING) H2 – Protein 13. Diese Studien wurden in sekundären geführt stammt von Pappeln und Eukalyptus Pflanzen und Einblicke in die Zellmorphologie, Zellwand Chemie und Genexpression.
Die Protokolle hier beschriebenen sollen die Erfahrung ein zusammen zu bringennd gewonnenen Erkenntnisse durch die Entwicklung und Anwendung der IVSS aus einer Reihe von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Studien im letzten Jahrzehnt. Sie konzentrieren sich auf die in – vivo – Transformation von Nebenschaftgewebe 6 und konzentrieren sich auf Studien mit Populus alba 'pyramidalis' Klon, Eucalyptus globulus sowie 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone. Dieses Dokument nimmt Forscher durch das Protokoll aus dem Anbau von Pflanzen und Bakterien, die Umwandlung von Stammzellen Gewebe, Wachstum und Ernte von Gewebe, die Identifizierung von transgenen Zellen und Geweben, die Vorbereitung auf phänotypische Einschätzungen und Verfahren zur Erhebung und Analyse von Daten. Während Techniken erfolgreich angewendet wurden Zellwand Monosaccharidzusammensetzung auch 9,11, aus Platzgründen zu messen, konzentriert sich dieses Dokument auf Techniken zur Messung der Zell- und Gewebemorphologie und das Verständnis von Genexpressionsmustern in sekundären st verwendetnur ems. Dementsprechend wird, wie das Protokoll zu denen weitere Einblicke in die Rolle und / oder Expression von Genen zur sekundären Stiele mit einem kostengünstigen, technisch einfach und mittlere bis hohe Durchsatzverfahren verknüpft zu gewinnen suchen geeignet skizziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die IVSS-Protokoll ist ein relativ einfaches und effizientes Verfahren zur Erzeugung transgener Stamm Gewebe in Baumarten in den Raum von ein paar Monaten für die Analyse von Genen und Promotoren von Interesse an Holz beteiligt und Bildung einzudämmen. Wenig Aufwand, über Pflanzen am Leben zu erhalten, ist erforderlich , transgene Stammgewebe nach der Impfung zu wachsen, die in – vitro – Verfahren im Gegensatz steht , wo umfangreiche Kultivierung erforderlich ist , Gewebe oder Pflanzen zu erhalten, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
