Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendritter af dopaminerge neuroner modtage og formidle synaptisk input, støtte handling potentiale back-propagation og neurotransmitter frigørelse. Forståelsen af disse grundlæggende funktioner vil belyse overførsel oplysningerne i disse neuroner. Dendritiske patch-clamp optagelser giver mulighed for direkte at undersøge de elektriske egenskaber af dendritter og underliggende spænding ionkanaler. Men disse fine strukturer er ikke let tilgængelige for patch pipetter, på grund af deres lille diameter. Denne rapport beskriver en trin-for-trin procedure til at indsamle stabile og pålidelige optagelser fra dendritter af dopaminerge neuroner i akutte skiver. Elektrofysiologiske målinger kombineres med post hoc genvinding af cellemorfologi. Vellykket eksperimenter afhængige forbedret forberedelse af skiver, løsninger og pipetter, passende justering af optik og stabilitet af pipetten i kontakt med den indspillede struktur. Standard principper for whichatic patch-clamp optagelse påføres dendritter men med en blidere tilgang af pipetten. Disse alsidige teknikker kan gennemføres til at løse forskellige spørgsmål vedrørende overgearet egenskaber dendritter.
Neuroner modtager synaptisk information overvejende om deres dendritter. Stimulerende og hæmmende synaptiske signaler spredes fra deres hjemmeside af generation til integrationen site, hvor aktionspotentialer (APS) er fremkaldt som udgangssignalet. På deres vej, er synaptiske potentialer påvirkes både af strukturen af dendritter og samspillet mellem passive og aktive membranegenskaber. Kombinationen af disse meget variable parametre udvider beregningskraft af neuroner 1,2. Men den lille diameter af dendritter hindrer imidlertid studiet af deres elektriske egenskaber. Den fortsatte udvikling af plasteret-clamp teknik 3, har optikken 4 og videreudvikling af metoder til skive forberedelse 5 i løbet af de sidste årtier aktiverede optagelser fra meget tynde (0,7-3 um Ø) dendritter 6,7. Disse metoder var, og er stadig i vid udstrækning anvendes til at undersøge ophidselse af dendritter i forskellige of neuroner 8. Direkte dendritiske optagelser er afgørende for at bestemme fordelingen 9-19 og forskelle i de funktionelle egenskaber 20-22 af ionkanaler i forskellige neuronale rum. Disse data er et nødvendigt supplement af ion-kanal distributioner detekteret med immunhistokemi kombineres til lys og elektronmikroskopi 23,24. Dual somatodendritiske optagelser er blevet gennemført for at undersøge udbredelsen af aktionspotentialer 9,13-15,21,22,25-27 og spredning af synaptiske potentialer 13,16,18 langs somatodendritiske domæne af neuroner, få detaljerede passive kabel modeller 28- 30 og undersøge den tidsmæssige opløsning af neuronal integration 31.
Den sorte substans (SN) er en region beliggende i den involveret i flere funktioner, såsom kontrol af bevægelser, kodningen af belønning og vanemæssige adfærd midthjernen. Faldet af dopamin skyldes den specifikketab af dopaminerge (DA) neuroner i SN er forbundet med de motoriske forstyrrelser hos patienter, der lider af Parkinsons sygdom 32. Den nigrale kredsløb er sammensat af to vigtigste celletyper: dopaminerge og GABAerge neuroner. Interessant, disse neuroner har flere specifikke funktioner, der adskiller dem fra andre neuroner. Den Axon af en stor del af DA neuroner og nogle GABA neuroner stammer fra en dendritisk websted angiver, at dendritiske Lysthuset er heterogen (Axon-bærende og Axon-mangler dendritter) 25,26,33. Morfologi disse neuroner kontrast derfor med den typiske organisation af neuroner, hvor overførslen information følger loven af dynamiske polarisering udsendes af Cajal: startende fra dendritter, til soma og endelig til axon 34. DA neuroner er også kendt for at frigive dopamin fra deres dendritter 35, generere sprængning aktivitet 36 og NMDA-receptor plasticitet 37. Den dissecaf disse fænomener er undvigende uden direkte optagelser fra det sted, hvor de er iværksat. For at få indblik i forholdet mellem den præcise placering og funktionelle egenskaber ionkanaler og deres rolle i den dendritiske ophidselse og informationsoverførsel i nigrale neuroner, direkte dendritiske optagelser er den foretrukne metode.
Denne rapport beskriver en detaljeret procedure, der kan bruges til at opnå enkelt og dobbelt patch-clamp optagelser fra dendritter af nigrale neuroner og den tilsvarende post hoc biocytin mærkning. De grundlæggende principper for lappe det somatiske og dendritiske membran er meget ens. Praktisk dog optagelser fra dendritiske steder kræver særlig optimering i forhold til somatiske optagelser. Vellykket dendritiske optagelser stole på kvaliteten af de skiver, optimal justering af optikken, blid tilgang af plasteret pipette og stabilitet af optagelserne.
Denne rapport beskriver en trin-for-trin-protokollen til at gennemføre dobbelt somatodendritiske hel-celle optagelser og lokale dendritiske optagelser. Det er nyttigt til bestemmelse af indflydelsen af ionkanaler (dvs. jeg h) på tidsforløbet af postsynaptiske potentialer og kortlægning af fordelingen af ionkanalen (I h) langs somatodendritiske domæne af nigrale DA-neuroner, hhv. Resulterende elektrofysiologiske målinger kombineres for at skrive hoc histokemi at inddrive cellemorfologi. Proceduren blev anvendt til at undersøge DA neuroner beliggende i substantia nigra, men kan generaliseres til tilstødende nigrale GABA-neuroner, ventral tegmentalområde DA neuroner eller andre midthjernen neuroner. Alle trin kan også følges for at undersøge andre ionkanaler udtrykt i dendritter af nigrale neuroner uden vigtige ændringer. En post-hoc visualisering er særlig relevant for neuroner med axon-bærendedendritter, såsom nigrale neuroner 25,26, hippocampale Oriens-Alveus interneuroner 21 eller nogle CA1 pyramidale neuroner 67. Interessant, neuroner, der deler denne funktion synes at være mere udbredt end generelt menes 67. Morfologisk analyse afslører også den nøjagtige position af elektroderne og Axon. Påvisning af sidstnævnte kan optimeres ved mærkning af proteiner udtrykt i Axon indledende segment (spændingsafhængige Na + kanaler eller ankyrin G) ved hjælp af immunhistokemi 68,69.
Pålideligheden af data indsamlet med dendritiske optagelser og efterfølgende neuronal mærkning uvægerligt afhænger af skive kvalitet. Maksimal indsats skal derfor anvendes til at bevare levedygtigheden af celler i vævet. Dette opnås med skånsom håndtering af sunde dyr, høj kvalitet værktøjer og reagenser, tilstrækkelig iltning af væv og iskolde temperaturer i hele forberedelsen af skiver. Stabile optageforholdene stole på udvalg af sunde neuroner. I helcelle-tilstand, bør seriemodstand i starten være så lav som muligt og holdes konstant gennem hele forsøget. Stabiliteten af optagelserne er yderligere afhængig af høj kvalitet manipulatorer blottet for afdrift og vibrationer. Disse forstyrrelser kan reduceres ved at optimere pipette stabilitet: kontrollere forbindelsen til pipette indehaveren og hovedtrin, kontrollere, at mikromanipulator kabler er slap, undgå pludselige ændringer i temperatur eller scene bevægelse og kontrol af mekanismen af manipulator. For to optagelser, er methylsulfat 13,15,21 medtaget i den intracellulære løsning, men gluconat 9,14,25 kan alternativt anvendes. Imidlertid kan den vigtigste anion ændrer membranpotentialet 70,71 og nogle spændingsafhængige strømme 72. Intracellulær opløsning kan suppleres med ATP, GTP og phosphocreatin at bevare physiologiske funktioner af neuroner. Derudover, tilsætning af et fluorescerende farvestof i pipetten opløsning (f.eks Alexa 594 eller Sulforhodamin 101 41) for at visualisere dendritter under en somatisk optagelse kan være nyttigt for eksempel at placere en trykpåføring (figur 7 i Ref. 41) eller en elektrisk stimulerende pipette. Pipetten løsning til celle-bundet optagelser indeholder en høj K + koncentration og ingen Na + optages store Ih. Bemærkelsesværdige Na + / K + koncentrationsforhold påvirker strømamplitude 10, omvendt potentiale af de nuværende 11 og gating af I h 73. Alternativt kan I h også registreres ved hjælp uden-outs 10. I denne optagelse konfiguration kan dog den intracellulære miljø i nærheden af kanalerne blive foruroliget. Følgelig forskelle i spænding-afhængig aktivering af I <sub> h observeres, når man sammenligner strømme opnået ved hjælp af celle-vedhæftede patches og uden-outs 10. Hævelse af neuroner er lejlighedsvis stødt under patch-clamp optagelse, og ofte skyldes forskellige årsager, såsom den lave kvalitet af vandet, stærk ubalance i osmolaritet eller pH mellem intra- og ekstracellulære løsninger 39 eller fejl i sammensætningen af løsninger. Kvaliteten af elektrofysiologiske optagelser har en direkte indvirkning på kvaliteten af morfologi af genvundne neuroner. Høj modstandsdygtighed somatiske pipetter anvendes til dobbelt optagelser (6 – 10 MQ, som i Refs 6,11.) Og for enkelte somatiske optagelser efter celle-bundet optagelser for at minimere fortynding af det intracellulære miljø 14. Helcelle-somatisk optagelse efter celle-attached optagelse derfor holdes kort (<10 min). Udenfor-out patches fra både somatiske og dendritiske pipetter er afgørende for korrekt lukning af cell membran og efterfølgende genopretning af cellen morfologi. Ud over cellens struktur, kan bestemmes den neurokemiske indhold til de registrerede neuroner 59,74. For eksempel kan det intracellulære protein tyrosin hydroxylase blive immunolabeled til utvetydig identifikation af DA neuroner 13.
DA neuroner er primært koncentreret i SN pars compacta, med en meget lavere densitet stede i SN pars reticulata, hvor de blandes med et højere antal GABA-neuroner 75. Mens cellelegemet af DA-neuroner er ofte større end den for GABA-neuroner, den visuelle identifikation af disse celler med IR-videomicroscopy er usikker og delvist hæmmet af opaciteten af pars compacta. For at omgå disse begrænsninger, kan den første udvælgelse af DA neuroner lettes ved brug af transgene mus, der udtrykker et fluorescerende markør i en bestemt population af neuroner (TH 65 eller DAT for DA neuroner, GADfor GABA-neuroner) og epifluorescensbelysning. Alternativt kan et fluorescerende farvestof indgå i opløsning af den somatiske elektrode for at lette visualiseringen af dendritter. Øget opløsning af det fluorescerende celle er anlagt af Nipkow spinning disk konfokal 14,22,30 eller to-foton mikroskopi 7 kombineres til IR-DGC 6. Adskillige fordele er relateret til DGC i sammenligning med DIC. Først, som DIC prismer ikke er påkrævet, IR-DGC billede kan overlejres med et fluorescens-billede 49,52,53,76. For det andet kan DGC kombineres med photostimulation og optogenetics 77.
En ulempe ved skive præparat er bevarelsen af integriteten af neuroner. DA neuroner udvide deres dendritter i de tre rumlige planer 78,79 og dermed trunkering af den dendritiske rum ikke helt kan undgås i skiver 80. Valget af orienteringen af skiverne (koronale, vandret eller parasagittal) er et trade-off. Oprindelsen af innervation og det eksperimentelle design skal anses for at vælge den rigtige retning skiver.
Direkte dendritiske patching er den anvendte teknik til at kortlægge fordelingen af funktionelle ionkanaler i de forskellige rum af celler. Desuden denne teknik tilbyder at bestemme variabiliteten i funktionelle egenskaber af kanaler 20. Som et supplement placering og tæthed af ionkanaler kan konstateres ved hjælp af immunhistokemi på de lette og elektronisk mikroskopi niveauer 17,23. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for at bestemme den kanal tæthed i små kaliber strukturer, som er utilgængelige for patch pipetter. Men disse kanaler kan være i en særskilt funktionel tilstand 24 eller endda inaktive i forhold til dem, optaget med patch-clamp-teknikker. Begge teknikker er derfor nødvendigt at få et fuldstændigt billede af placering og egenskaberionkanaler i en specifik cellulær område 17. Med udviklingen af spændingsfølsomme farvestoffer, er spænding billeddannelse blevet anvendt til at undersøge udbredelsen af AP'er og EPSP'er i neuroner på flere steder 81. Som et alternativ til dobbelt patch-clamp optagelser, kan denne tilgang også gennemføres for tynde dendritter, der ikke er tilgængelige for patch pipetter men nødvendiggør nøjagtig kalibrering af signalet og gennemsnit.
Mens DA neuroner i SN og ventrale tegmentalområde er almindeligt undersøgt via somatiske optagelser i den fysiologiske og patofysiologiske kontekst, de funktionelle egenskaber af deres dendritter forbliver stort set ukendt i begge betingelser. Patching fra dendritter er blevet implementeret for nigrale dopamin neuroner af adskillige grupper med succes 13,25,26 og er fortsat den foretrukne fremgangsmåde til at dissekere exciterbare egenskaber af disse fine subcellulære strukturer 8. Dendritiske optagelser giver en yderligere MULIGHEDERskabet at kontrollere effektiviteten og plasticitet synaptisk transmission og plasticitet dendritiske uro 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr. Vincent Seutin for hans konstante støtte, Christelle Gillissen og Laurent Massotte for fremragende teknisk bistand, Drs Jean Defourny og Sandra Ormenese for råd med konfokale mikroskop, Dr. Jacques markedsavance for gaven af den anden Axopatch 200B forstærker, GIGA-Imaging platform for deling af konfokal mikroskop og Imaris software og Dr. Stephen Freeman for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra de belgiske FRS – FNRS (U.N002.13 og T.N0015.13) og offentliggjort med støtte fra det belgiske University Foundation (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |