An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.
Dendritiske celler (DCS) er vigtige for at indlede immunreaktioner, dels gennem deres evne til at tilegne sig og shuttle antigenet til drænende lymfeknude (DLN). Mobiliseringen af DC'er til DLN er kompleks og er endnu ikke fuldstændigt belyst under infektion. Beskrevet heri er anvendelsen af en innovativ, enkel assay, der bygger på fluorchrom 5- og 6-carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) at spore migreringen af DC'er under trædepuden infektion med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i C57BL / 6-mus. Denne analyse muliggør karakterisering af huden DC delpopulationer, der aktivt flytter til dræning, popliteale LN som reaktion på BCG. Denne protokol stammer fra en BCG model, hvor vandrende hud DC'er blev identificeret ved flowcytometri. Assayet er venlig til studiet og identifikation af DC'er eller andre celler, der huser den popliteale LN efter inokulering af mikrober, deres metabolitter eller andre inflammatoriskestimuli i trædepuden, og følgelig at studere faktorer, der regulerer migreringen af disse celler.
DC'er lokaliseret i kroppens overflader fornemmer mikrober eller deres produkter, og dermed mobilisere via lymfekar til dræning LN (DLN) 1,2. Der er behov for denne flytning til transport af mikrobiel antigen til DLN og den deraf priming af immunresponser på den invaderende mikrobe. Faktisk blokade eller svigt af DC'er at migrere fra det inficerede væv til DLN muter T-celle-respons 3-5. Følgelig assays designet til at spore migration på enkelt-celle niveau er nyttige til at hjælpe tilskriver vandrende funktion til en given DC delmængde.
Der er en stor mængde data om mobiliseringen af huden DC'er til DLN. Sidstnævnte står for meget af den viden om DC migration fra betændte eller inficerede sites 2. Dette er ikke overraskende, da huden huser en stor population af DC'er og er en meget tilgængelig overflade til forsøg i laboratoriet mus. Flere teknikker er således blevet udviklet til at vurderemigration af murine DC'er fra huden til DLN 2. FITC hudpensling er langt den mest anvendte metode. I dette assay fluorochromet fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) fremstilles i en blanding med acetone og en kontakt irriterende. Denne cocktail påføres afhåret eller barberet hud og akkumuleringen af FITC-mærkede celler igen er analyseret i DLN. Migration kan også undersøges ved at injicere huden med fluorochrom-mærkede nano- eller mikropartikler, som muliggør sporing af fagocytiske celler, der har internaliseret de fluorescerende partikler i huden. Lymfekar kan også være kanylerede til direkte udtrække migrerer DC'er fra lymfeknuder. Dette er imidlertid teknisk udfordrende, især i mus. Antallet af DC'er opnået til efterfølgende analyse er også en begrænsende faktor.
På trods af mange tidligere undersøgelser af huden DC migration, er der stadig en mangel på oplysninger om hud DC mobilisering til DLN efter vaccination med Bacille Calmette-Guérin (BCG), den levende, svækket stamme af Mycobacterium bovis anvendes til at vaccinere mod M. tuberkulose. BCG inokuleres i huden, hvilket medfører en begrænset infektion, der udløser en T-hjælper-celle type 1 respons. Både DC delpopulationer, der mobiliserer til DLN fra BCG-inficerede hud og de faktorer, der regulerer deres vandring i løbet af denne proces er ikke fuldt forstået. På baggrund af ovenstående blev en enkel, men hidtil ukendt fremgangsmåde udvikles, hvor fluorochromet 5- og 6-carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiceres in situ at spore migreringen af DC'er i DLN 3. C57BL / 6 mus injiceres i bagpote med et inokulum på BCG og dagen før aflivning blev dyrene injiceret i den samme trædepude med en høj koncentration af CFSE. Fireogtyve timer senere aflives dyrene, og drænende popliteale LN (PLN) fjernet og forberedt for flowcytometri. Dette assay muliggør identification af celler, der vandrer natten over fra trædepuden huden til DLN (figur 1).
Desuden kan gen-målrettede mus anvendes til at hjælpe med at identificere faktorer, der kræves for celler at mobilisere til DLN. Anvendelse af dette assay har forfatterne af denne rapport tidligere fundet, at EpCAM lav CD11b høj vandrende hud DC'er transport BCG til DLN i en proces reguleres af interleukin-1-receptor og det intracellulære adapter molekyle MyD88 3. Protokollen for dette CFSE-baserede migration assay, som stammer fra ovennævnte rapport fra Bollampalli et al. 3, hvor flowcytometri blev anvendt til at detektere og analysere vandrende hud DC'er, er beskrevet heri. Fordelene og ulemperne ved dette assay er diskuteret.
noDCs er specialiserede antigen-præsenterende celler, som kan reagere på mikrobiel udfordring på kroppens overflader ved at erhverve mikrobiel antigen og migrere til DLN via lymfekarrene. Der, DC'er præsentere dette antigen til T-celler på en måde, der driver de primære T-celleresponser. Processen med DC migration fra væv til DLN er derfor meget vigtigt for at forstå hvordan en produktiv T-celle-respons initieres. Metoder til at måle DC migration er derfor meget nyttige i at udfolde ovenstående.
En musemodel blev anvendt til at studere huden DC migration til DLN efter infektion med BCG, en levende vaccine, der injiceres klinisk i huden. I tråd, er BCG injiceres i bagbenstrædepude at efterligne denne kutan rute for vaccination. En simpel analyse blev udviklet og derfor indført til denne model til at undersøge migration af huden DC delpopulationer fra BCG podningsstedet i trædepuden huden til dræning PLN. Denne protokol relies om indsprøjtning af fluorokrom CFSE i den samme trædepude at tidligere modtagne BCG og derefter isolering af den drænende PLN 24 timer senere for at analysere tilstedeværelsen af CFSE-mærkede celler ved flowcytometri. Selvom det ikke er beskrevet i protokollen, kan LN fra denne opsætning også være forberedt til analyse ved konfokal mikroskopi, for at studere migration processer såsom placeringen af migrerende celler i LN 3. Desuden lignende resultater på BCG-udløst hud DC migration er blevet opnået, ved hjælp af både BCG Pasteur 1173P2 3 og BCG SSI 1331 14.
CFSE er almindeligt anvendt til at mærke celler in vitro og at spore sådanne mærkede celler in vivo efter celle overførsler 15. I den nuværende protokol dog, blev det brugt til direkte mærke hudceller in situ. Den molekylære basis for CFSE mærkning ligner FITC, som også er en amin-reaktivt fluorescerende farvestof. CFSE er imidlertid foretrukket frem FITC til konjugation som det creAtes meget stabile carboxamidderivater obligationer 16. Desuden CFSE er stærkt membran permeabel og passivt diffunderer ind i celler. Når du er inde, det danner intracellulær amin (fluorescerende) konjugater, der bevares i den mærkede celle 15.
Den CFSE-baserede migration assay udviklet af forfatterne muliggør identifikation af celler, flytter fra hud til DLN inden for en 24-timers periode som reaktion på BCG. Den måler således akut migration under en defineret tidsramme, og gør det muligt at undersøge muligheden af forskellige, injicerede stimuli til at udløse migration. Dette assay er forskellig fra den klassiske teknik med FITC hudpensling, som måler en kumulativ migration begivenhed udløses af kutan, topisk påføring af en kontakt-sensibiliserende middel. Således kan CFSE-baserede migration assay anvendes til at identificere vandrende hud DC'er eller andre celler, hjem til PLN efter injektionen af mikrober, mikrobielle produkter eller andre inflammatoriske stimuli i footpad. Faktisk både neutrofiler og γ: har A T celler vist sig at flytte fra huden til DLN som reaktion på BCG 17,18. Faktisk blev analysen nylig brugt i en co-infektion indstilling til at vise, at en gut-lokaliseret nematode-infektion kunne slå BCG-udløst hud DC migration til DLN 14.
DC migration er ofte vurderes mellem 24 til 72 timer i FITC hudpensling siden FITC-mærkede DC'er er vanskelige at opdage 4 til 5 dage efter at male 19. Tab af CFSE signalet på mærket udviklingslandene er ikke et problem i analysen præsenteres her siden analyse af migration var begrænset til 24 timer; Grunden til dette er, at forfatterne ville specifikt studere "overnight" migration begivenheder. Andre interesserede i denne analyse er dog opfordres til at undersøge tidligere eller endda senere tidspunkter for CFSE-baserede tracking. Eftersom CFSE introduceres ved injektion, kan gives på et defineret tidspunkt. Denne fleksibilitet tillod enuthors at vurdere DC migration mellem dag 5 og 6 efter BCG-infektion (figur 2C) 3. Intravenøse CFSE potentielt kunne begrænse de celletyper tilgængelige in situ til mærkningsreaktionen. For eksempel Langerhanske celler (LCS), som er DC'er, der findes i det øverste lag af huden, epidermis, migrerer dårligt som reaktion på BCG i CFSE-baserede migration assay (figur 3) 3. Men under FITC hudpensling, DC'er placeret i dermis, laget under epidermis, let mærkes og migrere til DLN hurtigere end LC'ere 20,21. Dette antyder, at celler kan blive fluorochrommærkede uden nødvendigvis at skulle lokalisere til laget af huden, hvor mærkningen opløsningen påføres.
Som model for BCG-infektion, muse øre giver en bona fide intradermal rute podning, der er mere på linje med den kliniske administration af BCG som tuberkulose vaccine. footpad injektion på den anden side, er sandsynligvis en kombination af den intradermale og subkutane veje. Som sagt, det kræver dygtighed og uddannelse til korrekt og reproducerbart levere BCG til dermis 22, så i klinisk praksis kan det ikke altid gives virkelig intradermal men snarere subkutan eller en kombination af begge. Som en podningsstedet trædepuden har dog to meget klare fordele over øret der fortjener at nævne. Først er immunresponset koncentreret til dræning PLN efter en trædepudeinjektion og dette letter undersøgelsen af svarene. Forfatterne til denne rapport fundet PLN at være den første og vigtigste LN dræne trædepuden 3. Andre har foreslået split dræning mellem popliteale og subiliac LN efter injektion af Evans blå 23. Men i forhold til øret, der er mere end én øre DLN i mus, og disse kan ikke være regelmæssigt til stede eller let at lokalisere 24. Sidstnævnte klart introducerer en LIABility i undersøgelser, der søger at undersøge reaktioner i DLN. For det andet kan større mængder blive inokuleret i trædepuden (på 10 – 50 pi) i forhold til øret. Dette vil til gengæld både minimerer ansvar for at indføre større ændringer i lymfe flow og for at skulle arbejde med meget små injektionsvolumener, hvilket er et problem i sig selv, når det kommer til at pode store mængder mykobakterier. I øret, hvor injektionsvolumener skal være lille (1-10 pi), kan endda 5 pi ændre lymfe flow og potentielt tvinge en større mængde af det injicerede materiale direkte ind i DLN sig ukontrolleret. Det er derfor vigtigt at tage højde for injektionsvolumener. Dette er især vigtigt i forsøg rettet bidraget af celler i færger bakterier til LN. I BCG trædepude-modellen, kan nogle BCG har nået DLN i fravær af cellulære transport. Dette er baseret på den iagttagelse, at man stadig kan detektere BCG i DLN af mus, hvor cellemigrering fra fodenpuden blev fuldstændig ablateres ved lokal injektion af pertussis toksin 3. Om dette er en indikation af, at BCG direkte adgang lymfekar og nå DLN i et ægte cellefri måde skal stadig bestemmes, da det ikke kan udelukkes, at mykobakterier i dette tilfælde, hvor får adgang til lymfekarrene med magt af det injicerede volumen.
En praktisk overvejelse for immuniseringer i øret eller trædepuden er, at dyr har at være tilstrækkeligt immobiliseret til injektion skal udføres korrekt og på en reproducerbar måde. Isofluran gas er beskrevet i den nuværende protokol som en metode til at begrænse dyr som forberedelse til trædepuden injektioner. De relativt hurtig induktion og nyttiggørelse tider for isofluran-medierede anæstesi gør det en populær metode, men ligner andre bedøvelsesmidler, det påvirker fysiologi, der kan forstyrre eksperimentelle resultater 25. Faktisk både flygtige og injicerbare anæstetika sænke lymfeknuder flow ved at afskaffefrivillige muskelbevægelser, reducere muskeltonus, og faldende lymphangion sammentrækning 26. Desuden har en 5 gange reduktion i migrationen til DLN af DC'er adoptivt overført i trædepuden blevet rapporteret i bedøvede dyr 27. På baggrund af ovenstående og da procedurerne forud for anæstesi håndtering kan forårsage mere stress for dyrene end injektionen selv, som er både hurtig at administrere og kræver ikke et opsving skridt, at muligheden tilstrækkeligt begrænse dyret uden bedøvelsesmidler bør blive overvejet. En mus harpiksstopperen tilpasset trædepuden injektioner, hvor dyret kan hurtigt bragt til en immobiliseret position og inokuleret i trædepuden inden for 30 til 40 sekunder ville være ideelt at injicere mus i bagpote uden at ændre andre aspekter af dens fysiologi i processen , og ville være meget nyttigt i undersøgelser vedrørende celle migration gennem lymfekarrene.
Afslutningsvis denne rapportfremhæver en ny protokol til sporing hud udviklingslandene under deres mobilisering til DLN ved hjælp af en analyse, der overvåger migration under en defineret 24-timers-vinduet. Denne CFSE-baserede migration analysen muliggør detektion og analyse af migrerende celler ved flowcytometri som beskrevet her, såvel som ved konfokal mikroskopi 3. Den giver en fleksibel platform til at undersøge forskellige injicerede stimuli og deres evne til at udløse DC migration, og vigtigere, kan anvendes til at spore ikke blot DC'er men også andre befolkningsgrupper, der flytter fra hud til DLN under forskellige eksperimentelle indstillinger.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
EDTA | In house | ||
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
PBS | In house | ||
Filtered water | In house | ||
BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
6 well plates | TPP | 92006 | |
15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
Univentor 400 anaesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Monojet 3/10ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
Antibody | Clone | Company | |
Antibodies | |||
MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
CD103 | 2E7 | Biolegend | |
CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
CD86 | GL-1 | Biolegend |